前言痰涂片检查癌细胞是肺癌早期诊断的重要方法之一,并由于其简单易行,安全无损伤,能够重复检查,在许多国家和地区成为早期肺癌诊断最常用的方法之一。但由于受到多种因素的影响,国内外报道的阳性诊断率的差异颇大。因为在涂片过程中要抛弃大部分的样本细胞,造成标本的浪费;另外玻片上有大量血细胞、黏液等杂质干扰对肿瘤细胞的观察。这些都可能是造成痰检阳性率较低的原因。液基薄层细胞学检查(Thin-layer cytology test,TCT)是一种较新的细胞学检查方法,已经被广泛应用于宫颈细胞学检查。痰沉渣切片法也是痰液检查的重要方法之一,并且能够进行免疫细胞化学染色,对肺癌的分型有重要意义。本研究将传统涂片法、TCT和痰沉渣切片法同时应用于肺癌患者痰液的细胞学诊断中,并对三者进行比较和评价,明确三种方法在肺癌中的临床诊断价值。材料和方法一、材料1、研究对象将中国医科大学附属第一医院2007年1月～2008年1月经外科手术切除病理或纤维支气管镜活检证实为肺癌的107例患者作为研究对象。其中男性76例,女性31例,年龄35～81岁;组织学分型为肺鳞癌39例,肺腺癌45例,小细胞肺癌23例。收集107例患者的痰液。此外,收集同期的35例肺部非肿瘤性疾病患者的痰液作为对照。全部患者均接受痰液传统涂片,TCT和痰沉渣切片法的检查。2、主要试剂、仪器和来源美国新柏氏超薄细胞检测仪,ThinPrep保存液及处理液,95%酒精,石蜡,脱水机,奥林帕斯显微镜,福建迈新公司单克隆抗体CKH(克隆号:34βE12),CK7(克隆号:OV-TL 12/30+72.2),TTF-1(克隆号:8G7G3/1),NSE(克隆号:E27)等。二、方法1、实验方法:(1)传统涂片将痰液制成传统涂片4张,巴氏染色。(2)TCT的制备将痰液的一小部分直接加入30ml清洗液和7～8滴消化液(1,4-二硫苏糖醇)后振荡约10分钟。离心,2500转/分,5分钟。弃上清液,将少许沉淀加入到盛有保存液的小瓶中,静置10分钟后,用Thin Prep制成薄层细胞涂片,95%的酒精固定10分钟,巴氏染色。(3)痰沉渣切片将剩余的痰液倒入试管中,加入95%的酒精,吹打均匀后离心,2500转/分,5分钟。取出沉渣,石蜡包埋,4μm连续切片。选2张切片进行HE染色。(4)免疫细胞化学染色对于通过传统涂片,TCT和痰沉渣切片法仍不能分型的病例进行免疫细胞化学染色。石蜡切片(4μm)后脱蜡水化。滴加过氧化物酶阻断溶液(试剂A),室温孵育10分钟,PBS冲洗;滴加非免疫性动物血清(试剂B),室温孵育10分钟;滴加一抗,室温孵育90分钟,PBS冲洗;滴加生物素标记的二抗(试剂C),室温孵育20～30分钟,PBS冲洗;滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D),室温孵育20～30分钟,PBS冲洗;最后DAB显色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中树胶封固。2、统计学分析:对所得结果各组间用SPSS13.0软件进行x~2检验,P＜0.05有统计学意义。结果一、TCT与传统涂片比较的结果TCT与传统涂片相比具备如下优点:①细胞涂膜面积明显缩小,工作效率明显提高;②能够最大程度的收集癌细胞;③涂片背景干净,阳性细胞不易漏诊;④三维立体感突出,细胞图像清晰,层次分明,核膜、核仁及染色质等细微结构清晰可见;⑤肺鳞癌,肺腺癌和肺小细胞癌的癌细胞均具有各自的特点;⑥可以根据需要制作多张涂片,且细胞形态保存完好。二、痰沉渣切片与传统涂片比较结果痰沉渣切片与传统涂片相比具有如下优点:标本含量多,制作过程中没有人为的外力拉扯作用,所以常保持一定的组织结构,观察起来比较清晰。其细胞学表现与TCT相似。然而痰沉渣中包含很多成分,切片背景不如TCT干净,但癌细胞成分清晰可见,且无细胞重叠现象。三、痰传统涂片法、TCT和痰沉渣切片法及TCT+痰沉渣切片法检测肺癌细胞阳性率的比较在107例肺癌中,用传统涂片法仅有61例出现了癌细胞,其阳性诊断率仅为57.0%(61/107);TCT的阳性诊断率为72.0%(77/107),两者差异具有统计学意义(P＜0.05);痰沉渣切片法的阳性诊断率为70.1%(75/107),与传统涂片法比较,差异具有统计学意义(P＜0.05),但是与TCT比较,差异无统计学意义;TCT与痰沉渣切片法联合应用,其阳性诊断率可高达83.2%(89/107),与传统涂片法、TCT和痰沉渣切片法比较时,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。四、痰沉渣切片免疫细胞化学染色在没有分型的17例病例中,通过传统涂片,TCT和痰沉渣切片的观察,有9例诊断为查到癌细胞或查到可疑癌细胞,5例诊断为细胞异型增生。通过免疫细胞化学染色,结果显示:2例为CKH阳性,属鳞癌;4例为CK7和TTF-1阳性,属腺癌;1例为NSE阳性,属小细胞肺癌;4例证实为细胞增生;其余的3例因为脱片或痰沉渣切片内的细胞含量过少无法进行免疫细胞化学染色。结论1、TCT在痰液制备和染色方面便于实施质量控制,应推广为普查肺癌的一种方法。2、TCT和痰沉渣切片法联合应用在肺癌早期诊断中具有重要的临床价值。尤其是对影像学上表现为中心型肺癌而怀疑为肺鳞癌的患者,更应该联合应用TCT和痰沉渣切片法检查,可以显著提高肺鳞癌的诊断率。3、对于不能分型的病例进一步进行免疫细胞化学染色,可以提高肺癌细胞的诊断率。