农杆菌是一类生长在土壤中的植物病原菌。根癌农杆菌感染植物细胞后,会扰乱细胞分裂而使其发生癌变。农杆菌介导的遗传转化是植物转基因的首选方法,但其转化效率低和转化结果的不可预测是转基因技术面临的重要问题。我们尝试进一步了解农杆菌T-DNA转运的分子机理,探讨是否可以通过提高T-复合物招募蛋白VBP在农杆菌细胞内的表达量来提高T-DNA的转化效率,此研究对其在植物转基因方面的应用具有重要意义。本课题对农杆菌T-复合物招募蛋白VBP2的编码基因Atu4860的表达调控机理进行了研究。内容：1.通过PCR得到该基因5’端上游可能含有转录活性的DNA片段。将gfp和50O bp Atu4860启动子组成嵌合基因,体外构建以egfp为报告基因的启动子探针载体pRSET-AGFP2,转化大肠杆菌,通过抗生素筛选及对EGFP的追踪观察,初步确定有启动子转录活性的基因片段。2.构建包含Atu4860上游较短序列的重组质粒,找出对于Atu4860基因启动子活性比较核心的启动子区域。3.作为质粒拷贝数变化的参照,以农杆菌中组成型表达的50S核糖体蛋白的编码基因Atu3617的启动子来驱动红色荧光蛋白基因的转录,酶切后将该基因片段插入到载体中的多克隆位点,为绿色荧光蛋白的定量分析提供依据。4.采用不同的诱导条件(培养基,温度,pH)培养含有pRSET-AGFP2S质粒的大肠杆菌,研究环境因素如何影响Atu4860启动子的活性。5.根据在线软件中转录因子fadR结合位点、rhaS结合位点、CAP/CRP结合位点位置权重矩阵的统计结果,设计引物,使用重叠延伸PCR针对三个重要的碱基做定点突变。使用倒置荧光显微镜定性分析荧光蛋白的表达情况,并使用荧光光度计对其做定量分析。6.由于以上的实验是根据生物信息学软件的预测结果来设计的,我们根据前人的研究结果,采用不同的诱导条件来验证农杆菌中是否真的存在转录因子fadR结合位点、rhaS结合位点及CAP/CRP结合位点。结论：(1)成功构建启动子探针载体并转化大肠杆菌。(2)确定Atu4860上游175bp的序列为具有启动子活性的比较核心的启动子区域。(3)红色荧光蛋白在大肠杆菌中得到正确表达。(4)利用生物信息学软件预测到的该启动子序列中的CAP/CRP结合位点可能参与该基因的表达调控。(5)当大肠杆菌处在不同的温度和pH条件下,受Atu4860启动子调控的EGFP的表达量不同,预示着Atu4860基因的启动子可能受温度和pH的调控。(6)-125位碱基A不是关键的调控位点,-140位碱基G对基因的转录起着负调控的作用,-107位碱基G对基因转录起着正调控的作用。农杆菌中T-复合物招募蛋白Atu4860是在培养初期就开始表达,培养中期蛋白表达量开始减少,晚期表达量较低。(7)Atu4860上游启动子序列中存在转录因子fadR结合位点及CAP/CRP结合位点,不存在转录因子rhaS结合位点。