论文部分内容阅读
细胞色素P450是一类具有多种生物功能的古老家族酶系，广泛存在于生物体中，参与外源物质的代谢、内源物质如蜕皮激素、保幼激素的合成分解、脂类合成等生物过程。细胞色素P450还原酶是细胞色素P450酶系的重要组成部分，主要负责电子传递，促进细胞色素P450行使功能。本文以飞蝗为研究对象，从分子水平研究了P450的组织特异性及11种药物（包括杀虫剂、植物次生代谢物以及几种常见诱导物）对其的诱导表达，并研究了飞蝗细胞色素P450还原酶（CPR）的分子特性。 本研究主要内容包括：⑴基于实验室前期研究成果，对本课题组所获得的P450全长基因与果蝇全部P450基因进行聚类分析，从中挑选处于不同分类地位的10个 P450基因（ LmCYP6HL1、LmCYP6FE1、LmCYP6FF1、LmCYP6FG1、LmCYP4C73、LmCYP4C79、LmCYP4C80、LmCYP4G62、LmCYP4FD1和LmCYP302A1）进行组织特异性研究，检测了其在5龄若虫11个组织部位（脑、前肠、中肠、后肠、胃盲囊、马氏管、精巢、卵巢、肌肉、表皮和血淋巴）的表达量，研究发现在触角高表达的基因为 LmCYP6FE1，在马氏管高表达的基因有 LmCYP6FE1和LmCYP6FF1，在脂肪体相对高表达的基因有 LmCYP6HL1、LmCYP4C79、LmCYP4C80和 LmCYP4FD1，在中肠和胃盲囊表达量相对较高的基因有LmCYP4FD1和LmCYP4C79，在卵巢表达量相对较高的基因为LmCYP302A1，在表皮高表达的基因为LmCYP4G62。⑵采用11种药物处理飞蝗3龄若虫，研究10个P450基因（LmCYP6HL1、LmCYP6FE1、LmCYP6FF1、LmCYP6FG1、LmCYP4C73、LmCYP4C79、LmCYP4C80、LmCYP4G62、LmCYP4FD1和LmCYP302A1）对外源物质的响应。所采用的11种药物包括杀虫剂西维因（carbaryl）、毒死蜱（chlorpyrifos）、马拉硫磷（malathion）、烯虫酯（methoprene）、早熟素I（precocene I）；植物次生代谢物有花椒毒素（xanthtoxin）、吲哚（indole）、吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol）、2-十三烷酮（2-tridecane）；以及两种其他常用诱导物氯贝丁酯（clofibrate）和巴比妥（barbital）。杀虫剂西维因（carbaryl）可以显著诱导LmCYP4G62，诱导倍数为1.8。毒死蜱（ chlorpyrifos）可以显著诱导 LmCYP6HL1，诱导倍数为1.5。马拉硫磷（malathion）对LmCYP6HL1和LmCYP4G62的诱导作用显著，诱导倍数分别为1.9和1.4。而毒死蜱（chlorpyrifos）、马拉硫磷（malathion）对LmCYP4C73的表达有显著的抑制作用。保幼激素类似物烯虫酯（ Methoprene）对6个飞蝗P450基因的表达产生影响，其中表达量上调的有LmCYP6HL1、LmCYP6FE1、LmCYP4C73，表达量下调的基因有LmCYP6FF1、LmCYP4C79和LmCYP302A1，其中对LmCYP6HL1的诱导倍数达到2.7倍。而抗保幼激素早熟素I（precocene I）只对2个基因的表达产生诱导上调效应，其中LmCYP6HL1为2.6倍，LmCYP6FE1为1.7倍。植物次生代谢物中槲皮素（quercetin）对所检测的10个飞蝗细胞色素P450基因并没有产生作用，吲哚（indole）对飞蝗P450基因的作用比较明显，可显著诱导LmCYP6HL1（2.6倍）、LmCYP6FG1（1.2倍）、LmCYP4C79（1.4倍）表达水平，但对LmCYP6FF1、LmCYP4G62和LmCYP302A1却产生了明显的抑制；2-十三烷酮（2-tridecane）诱导了5个基因的表达，具体情况为 LmCYP6HL1（2.6倍）、LmCYP6FF1（2倍）、LmCYP6FG1（1.6倍）、LmCYP4C73（1.8倍）和LmCYP4C79（1.8倍）；花椒毒素（ xanthtoxin）对LmCYP6HL1的诱导倍数高达4.3倍，对 LmCYP6FE1的诱导上调倍数也达到1.9倍；吲哚-3-甲醇（ indole-3-carbinol）只诱导了LmCYP6HL1、LmCYP6FE12个基因的表达，诱导倍数分别为1.9和2.0。神经类药物氯贝丁酯（clofibrate）和巴比妥（barbital）对飞蝗P450基因表达的影响不明显，只对2个基因产生影响。氯贝丁酯（ clofibrate）抑制了LmCYP6HL1的表达，LmCYP302A1产生了2倍的上调；相反巴比妥（barbital）诱导了LmCYP6HL1的表达，诱导倍数为1.6，而LmCYP302A1的表达量却下调。三、细胞色素P450还原酶LmCPR分子特性研究对飞蝗细胞色素P450还原酶LmCPR时空表达研究结果显示，LmCPR在卵期最后一天及孵化前一天表达量最高，而在孵化后的1-3龄LmCPR的表达量呈上升趋势，在4龄达到顶峰，5龄和成虫期有所下降。LmCPR在触角和卵巢高表达，表皮和后肠次之，其他组织均有不同程度的表达。