HIV-1整合酶(integrase, IN)能够介导HIV病毒DNA与宿主染色体的整合,是病毒复制周期中必不可少的酶,由HIV-1病毒pol基因编码,分子量为32kDa,抑制整合酶能够有效阻止病毒在体内复制。同时,人体细胞中无整合酶的功能类似物,因此,整合酶是抗HIV-1药物的理想靶点。HIV-1整合酶在体内通过催化3′端加工和链转移两步反应,实现病毒DNA与宿主基因组的整合。整合酶特异性地识别病毒DNA LTR的CAGT-3′序列,切除末端的GT二核苷酸,暴露出高度保守序列CA-OH3′,病毒cDNA的3′端腺苷酸通过转脂反应以3′-OH同宿主DNA切口的5′端的磷酸基团形成新的磷酸二酯键,实现共价结合。晶体结构研究显示:整合酶由三个结构域组成:1、N端结构域:包含锌指结构,能够促进整合酶的四聚化,影响C端区与病毒cDNA的结合;2、核心结构域:是整合酶发挥功能的关键区域,三个高度保守的酸性氨基酸残基:Asp64,Aspll6和Glu152为酶的活性中心,能够结合二价金属阳离子(Mg2+/Mn2+),形成DD35E型结构;3、C端结构域:其主要功能是非特异性结合DNA,介导蛋白质分子内和分子间的相互作用。由于HIV复制过程中存在高突变率,极易使病毒对药物产生抵抗作用——抗药性。1996年,何大一博士提出了联合使用多种药物治疗艾滋病,即高效抗逆转录病毒疗法(HAART),其配方为两种RTIs加一种PIs。HAART能高度抑制病毒复制,有效降低感染者的死亡率,提高生存率,但HAART治疗失败率仍然较高,有较多副作用,且停药后病毒载量会迅速反弹。另外,使用HAART的地区患者已经产生了抗药性。2007年10月,第一个以整合酶为靶点的药物raltegravir获准上市, IC50值比raltegravir还要低的elvitegravir也处于三期临床阶段,但是前期实验中发现病毒对这两种药物也已产生抗药性,所以,抗药性机理的研究就越来越受到人们的关注。本论文的研究目的: (1)构建整合酶突变体pET-28a(+)/IN(T66I)、pET-28a(+)/IN(G118A)、pET-28a(+)/IN(T66I/G118A);(2)表达、纯化三种整合酶突变体;(3)测定整合酶突变体的链转移催化活性; (4)研究T66I突变对蛋白可溶性表达的影响。本论文的研究方法:(1)从分子模拟的结果中获得整合酶残基间相互作用信息,应用重叠PCR的方法导入设计的突变T66I、G118A、T66I/G118A,在E. coli BL21(DE3)中表达突变蛋白,应用镍亲和层析的方法纯化,采用基于磁珠的酶联免疫吸附试验方法鉴定整合酶突变体与S-1360相互作用后的链转移反应活性。(2)在相同的条件下表达纯化野生型IN(F185K/C280S)和IN(T66I),采用多步离心和过滤的方法去除悬浮的包涵体,应用SDS-PAGE和His标签蛋白染色试剂盒分析两种蛋白可溶性的差别。本论文的研究结果:(1)成功构建了pET-28a(+)/IN(T66I)、pET-28a(+)/IN(G118A)、pET-28a(+)/IN(T66I/G118A),纯化到蛋白IN(T66I)、IN(T66I/G118A)。(2) SDS-PAGE和his标签蛋白质染色进行分析,结果表明IN(T66I)可溶性约是WT的2.4倍。600ml培养基中诱导表达IN/T66I/BL21,亲和层析纯化共收获蛋白质4.72 mg。用基于磁珠的ELISA方法测定IN(T66I)和IN(F185K /C280S)链转移催化活性,结果显示两种蛋白质活性基本相当。本工作提供了有别于F185K /C280S突变的另外一种实现整合酶可溶性表达的途径,IN(T66I)重组蛋白还可以应用到整合酶抑制剂筛选中,以获取避开T66I抗药性突变的抑制剂。