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研究目的:抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)是以动脉或静脉血栓形成、反复的妊娠并发症为主要临床表现,同时血清中持续存在抗磷脂抗体(antiphospholipid antibodies,APL)。其中,APL的靶抗原主要为血浆磷脂结合蛋白beta-2糖蛋白I(beta-2 glycoprotein I,β2GPI),抗β2GPI抗体是APS重要的致病性自身抗体。抗β2GPI抗体与膜结合性β2GPI相互作用使单核细胞、血小板及内皮细胞活化,其中Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)是细胞活化过程中重要的中间体。大量研究发现,TLR4在β2GPI介导细胞活化、表达活性因子的过程中发挥着主要作用,但对TLR2是否参与细胞活化及其作用机制尚未明确。本论文重点探讨TLR2是否参与介导β2GPI/抗β2GPI复合物激活小鼠腹腔巨噬细胞,以及在此过程中TLR2与TLR4的相对重要性。研究方法:(1)应用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测巨噬细胞表面标志F4/80及CD11b,以鉴定分离的BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞的纯度。(2)采用β2GPI/抗β2GPI复合物、Pam3CSK4(TLR2激动剂)、脂多糖(LPS)、β2GPI/抗β2GPI/TAK-242(TLR4阻断剂)、β2GPI/抗β2GPI/anti-m TLR2-Ig G(TLR2阻断剂)、β2GPI/抗β2GPI/TAK-242/anti-m TLR2-Ig G不同组合体外处理小鼠腹腔巨噬细胞,应用FCM及实时定量PCR(quantitative reverse transcription PCR,q RT-PCR)分别检测不同处理后的TLR2蛋白及m RNA表达。(3)q RT-PCR和Western blot、细胞免疫荧光分别从m RNA和蛋白水平检测不同处理组小鼠巨噬细胞IL-6、IL-1β及TNF-α的表达状况,观察TLR2能否介导β2GPI/抗β2GPI复合物促进巨噬细胞表达炎性因子。(4)qRT-PCR检测TLR2阻断剂和TLR4阻断剂预处理后β2GPI/抗β2GPI诱导的小鼠巨噬细胞MCP-1和TF的m RNA表达,ELISA检测MCP-1分泌水平,活性试剂盒检测TF活性,观察TLR2、TLR4阻断剂对β2GPI/抗β2GPI复合物诱导的MCP-1及TF表达的干预作用。(5)Western blot检测β2GPI/抗β2GPI复合物诱导小鼠巨噬细胞NF-κB p65的表达及其磷酸化程度,利用TLR2阻断剂和TLR4阻断剂处理巨噬细胞,观察TLR2是否通过NF-κB介导的信号通路激活小鼠巨噬细胞。研究结果:(1)流式细胞仪检测的BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞表面标志F4/80、CD11b阳性率约为93%,分离的细胞纯度高。(2)β2GPI/抗β2GPI复合物、Pam3CSK4、LPS均可增加小鼠腹腔巨噬细胞TLR2蛋白及m RNA表达水平(p<0.05 vs control),anti-m TLR2-Ig G、TAK-242及二者联合使用对TLR2蛋白表达的抑制效应无统计学意义,而anti-m TLR2-Ig G能抑制上述刺激物对TLR2 m RNA表达的促进效应(p<0.05 vsβ2GPI/抗β2GPI),但弱于TAK-242的抑制效应,anti-m TLR2-Ig G与TAK-242联合使用未显示更强的抑制效应。(3)β2GPI/抗β2GPI复合物、Pam3CSK4、LPS能明显增强小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-αm RNA表达,该效应可被anti-m TLR2-Ig G抑制,但弱于TAK-242的抑制效应,而二者合并使用并未显示更强的抑制效应,IL-6、IL-1β及TNF-α的蛋白表达水平也与其m RNA表达趋势相似。(4)小鼠腹腔巨噬细胞经β2GPI/抗β2GPI复合物、Pam3CSK4及LPS体外刺激后MCP-1、TF的m RNA水平显著升高,anti-m TLR2-Ig G可抑制该作用,但TAK-242的抑制效应更强,二者合并使用显示最强的抑制效应,MCP-1蛋白分泌水平及TF活性与其m RNA表达趋势一致。(5)巨噬细胞经β2GPI/抗β2GPI复合物、Pam3CSK4及LPS刺激后p-NF-κB p65表达增强,anti-m TLR2-Ig G对β2GPI/抗β2GPI复合物刺激巨噬细胞表达p-NF-κB p65的抑制效应弱于TAK-242的抑制效应,二者合并使用显示抑制效应最大。结论:(1)β2GPI/抗β2GPI复合物激活小鼠腹腔巨噬细胞过程中,TLR2表达增加,TLR2、TLR4阻断剂可降低TLR2 m RNA表达水平,提示TLR2在抗磷脂综合征病理过程中发挥一定作用。(2)β2GPI/抗β2GPI复合物明显增强小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子、MCP-1及TF的表达,TLR2阻断剂可抑制该效应,而TLR4阻断剂的抑制效应更强,说明TLR2部分参与了β2GPI/抗β2GPI复合物激活巨噬细胞的过程。(3)TLR2阻断剂可抑制β2GPI/抗β2GPI复合物对小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB信号分子的活化作用,但弱于TLR4阻断剂的抑制作用,二者联合使用显示更强的抑制效应,表明TLR4及TLR2均经由NF-κB信号通路参与抗磷脂综合征的病理过程,TLR2作用弱于TLR4。