紫叶酢浆草花青素合成及调控分子机理的研究

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紫叶酢浆草(Oxalis triangularis subsp.papilionacea)因其叶片具有独特的紫色外观,常常被当作一种园艺植物种植在各种盆栽和花园之中,具有较大的观赏价值。花青素作为一种水溶性黄酮类色素,不仅能使植物呈现出从黄色到蓝色的缤纷色彩,也在植物的逆境抵抗中发挥作用。目前,青素生物合成及分子调控机理在许多植物中已被阐述得很清楚,然而,酢浆草中花青素的合成调控机理还处于空白,甚至连酢浆草的基因组序列也未见报道。本研究以紫叶酢浆草(Oxalis triangularis subsp.papilionacea)和红花酢浆草(Oxalis corymbosa DC)为试验材料,取其叶片进行无参转录组测序,以此对酢浆草花青素合成的分子机理进行初步的探索。主要研究结果如下:(1)表型分析和花青素含量分析表明,紫叶酢浆草叶片呈紫色,花瓣则为淡紫色,而红花酢浆草叶片为绿色,花瓣呈现紫红色;紫叶酢浆草叶片的花青素含量远高于红花酢浆草,而紫叶酢浆草花瓣的花青素含量低于红花酢浆草。液相色谱串联质谱分析(LC-MS/MS)结果表明,酢浆草叶片所含有的花青素成分包括三种:锦葵色素-3-O-(4-O-(6-O-丙二酰葡萄糖苷)-鼠李糖)-5-O-(6-O-丙二酰葡萄糖苷)、锦葵色素-3,5-O-二-O-葡萄糖苷和飞燕草素-3-O-芸香糖苷,其在两种材料中的差异倍数值(Fold change)分别为476666.67倍、25.93倍和36.06倍。(2)对紫叶酢浆草和红花酢浆草叶片中花青素相关差异表达基因进行筛选,找出了7个花青素合成相关基因:PAL、CHS、CHI、F3H、F3’5’H、ANS和UA3GT,以上基因均在紫叶酢浆草叶片中上调;以及6个与花青素调控相关的转录因子基因:MYB113、TT8、TTG1、GL3、TTG2、CPC,其中MYB113、TT8表达量在紫叶酢浆草叶片中上调,TTG1、GL3、TTG2、CPC表达量在紫叶酢浆草叶片中下调。(3)根据转录组测序结果,对紫叶酢浆草和红花酢浆草的叶片及花瓣的花青素相关基因进行q RT-PCR检测,结果显示,紫叶酢浆草叶片中花青素合成通路基因PAL、CHS、CHI、F3H、F3’5’H、ANS、UA3GT和转录因子基因MYB113、TT8表达水平上调,而花瓣中,通路基因F3H、F3’5’H和转录因子基因TTG2表达量下调,表明促进紫叶酢浆草叶片花青素积累的可能是通路基因PAL、CHS、CHI、F3H、F3’5’H、ANS、UA3GT和转录因子MYB113、TT8;引起红花酢浆草花瓣花青素含量上调的基因很可能是F3H、F3’5’H和转录因子TTG2。(4)紫叶酢浆草进行低温及黑暗处理实验结果显示,低温条件在一定程度上促进了花青素的积累;黑暗状态下紫叶酢浆草的花青素积累被显著抑制。相关基因的q RT-PCR结果表明,低温下花青素合成的促进可能是花青素合成通路基因CHS、CHI和转录因子基因TT8、TTG1、GL3、TTG2表达量的提高引起的,而黑暗条件下花青素合成受到抑制可能是由于通路基因F3H、F3’5’H和转录因子基因MYB113、TT8表达水平下降引起的。另外,由于黑暗条件下紫叶酢浆草仍然有少量花青素的存在,表明紫叶酢浆草的花青素合成可能有另一条不受光照限制的途径。(5)低温和黑暗胁迫下紫叶酢浆草叶片中可溶性糖、可溶性蛋白、总酚测定结果表明,可溶性蛋白、可溶性糖在紫叶酢浆草低温和黑暗胁迫下的花青素合成中具有促进作用,此外,低温促进酚类合成,而黑暗抑制酚类生成。(6)对转录组测序结果中上调倍数最高的转录因子Ot MYB113基因进行克隆,构建其超表达载体p BI121-Ot MYB113,并转化野生型番茄AC++子叶外植体,诱导愈伤组织。然而,重组番茄愈伤组织并无明显变化,说明我们克隆的Ot MYB113很可能并不是紫叶酢浆草叶片变紫的关键基因。另外,序列分析还显示,从Ot MYB113的起始密码子算起,270bp左右即出现了它的终止密码子,使得Ot MYB113蛋白只包含89个氨基酸,与其他物种MYB转录因子相比,本研究克隆得到的Ot MYB113序列只含有DNA结合域,缺少转录激活域,使其并不能提高酢浆草花青素的含量,表明紫叶酢浆草中还存在我们没有发现的花青素合成促进相关的MYB转录因子。综上所述,影响紫叶酢浆草叶色及花色的是花青素,花青素合成通路基因PAL、CHS、CHI、F3H、F3’5’H、ANS、UA3GT和转录因子基因MYB113、TT8与紫叶酢浆草叶片花青素积累有关;花青素合成通路基因F3H,F3’5’H和转录因子基因TTG2与红花酢浆草花瓣的花青素积累有关;低温对紫叶酢浆草花青素的积累具有一定的促进作用,而黑暗对其有较大的抑制作用。
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