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奶牛乳腺炎是造成经济损失最严重的疾病,且严重影响动物福利及产品质量。它的发生主要是入侵病原体与机体免疫系统相互作用的结果,其中金黄色葡萄球球菌是主要的致病菌。蛋白质组学和生物信息学相结合,是研究免疫系统与病原菌的相互作用过程的有效方法。当机体感染临床乳腺炎时,蛋白质组学的应用,可以获得更加全面和准确的机体反应特性,并识别生物标记,更好的检测和预防疾病的发生,减少牧场的经济损失。本文利用iTRAQ(相对和绝对定量同位素标记)技术探索乳腺炎对乳腺组织中蛋白质组水平的影响。筛选健康乳腺组织和患病乳腺组织中差异表达蛋白,并利用生物信息学的方法对所筛选到的蛋白进行分析,寻找与奶牛炎症、免疫或组织损伤相关的蛋白,并对一些候选基因进行了进一步的表达调控分析,实验主要内容如下：一金黄色葡萄球菌感染的奶牛临床乳腺炎乳腺组织蛋白组表达特征本试验利用相对和绝对定量同位素标记技术(iTRAQ)筛选感染后期的乳腺组织中与乳腺炎相关的蛋白。利用iTRAQ和Orbi串联质谱技术(Orbi-MS/MS)分析健康乳腺组织和乳腺炎乳腺组织,利用GO分析方法分析差异表达的蛋白,利用ProteinPilot软件和DIA方法分析转录调控网络,利用蛋白质印迹法(Western blotting)和免疫组织化学染色法(IHC)对一组侯选蛋白进行分析。错误发现率5%时,从6499个多肽中筛选出768个蛋白,它们与15879光谱图相对应。与健康乳腺组织相比,被金黄色葡萄球菌自然感染的乳房组织中,有36个蛋白表达量明显升高(>1.5倍),19个明显降低(<0.67倍)。蛋白质印迹法(Western blotting)结果表明,与健康组相比乳腺炎组中COL1A1和ITIH4蛋白的表达量均有显著的增加(P<0.05)；免疫组织化学染色法(IHC)也检测到乳腺炎组织中两个蛋白的表达。本实验探究了机体对乳腺炎病原体的迟发反应,揭示了与宿主组织损伤相关的机制。生物信息学分析表明乳腺炎对一些蛋白表达的影响,如胶原蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、酪蛋白以及类肝素硫酸蛋白聚糖2。患乳腺炎乳腺组织中,COL1A1, COL1A2和ITIH4的高表达可能与乳腺炎感染晚期的组织损伤和修复相关。二奶牛CoL1A2基因启动子区甲基化与其基因表达及乳腺炎发生的相关性本研究了分析奶牛健康乳腺组织和金黄色葡萄球菌感染的乳腺炎组织中胶原蛋白Ⅰ型α2链(COL1A2)基因启动子区CpG岛甲基化与COL1A2基因表达的调控关系。利用生物信息学方法,分析了COL1A2基因启动子区CpG岛分布及其转录因子结合位点,运用亚硫酸氢盐测PCR(BSP)和RT-PCR法,分析健康乳腺组织和患乳腺炎乳腺组织中,COL1A2基因启动子区的CpG岛甲基化程度与COL1A2基因表达及乳腺炎的相关性。结果表明,健康乳腺组织和患乳腺炎乳腺组织中CpG岛甲基化差异不显著(P>0.05),均呈低甲基化状态(<50%),但位于转录因子SP1结合区域内的第4和第5 CpG位点,健康组甲基化程度(30%和60%)显著高于患病组(0%和10%)；健康组COL1A2基因mRNA表达水平显著低于患乳腺炎组(P<0.05)。提示,COL1A2基因在不同乳腺组织中的差异表达可能与其启动子区CpG岛转录因子SP1结合区域内的第4和第5 CpG位点甲基化程度差异相关,可能是其在乳腺炎发生过程中调控该基因表达的一种方式。