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家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目(Lepidoptera)模式昆虫,遗传背景清晰。目前为止,已经被鉴定的家蚕突变体超过600种,其中有200多种被定位于28个连锁群上。对家蚕体色突变体的研究不仅有助于了解鳞翅目昆虫色素代谢的相关基因及调控网络,还能为相关功能基因的利用提供新思路。Sel是家蚕黄浮黄体色突变体,位于24-0.0座位,幼虫期体色呈现黄色。此前的研究结果表明,Sel突变体中的墨蝶呤脱氨酶活性高于正常家蚕,且体内积累的墨蝶呤脱氨产物亦高于正常家蚕;Sel初步定位的位点与SSR分子标记S2404的遗传距离为12 cM。至今,Sel的分子实质尚未得到分离鉴定,人们对Sel所参与的调控昆虫色素合成及体色模式形成的分子机制的认识非常有限。 本文根据对家蚕遗传连锁图谱的分析,结合候补基因的功能与Sel突变体的表型相关性,以家蚕鸟苷三磷酸环化水解酶(GTP Cyclohydrolase I,GTPCH I)基因、胆色素原脱氨酶(Porphobilinogen deaminase,PBGD)基因、以及RNA编辑酶--腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase acting on RNA,ADAR)基因为Sel候补基因,在野生型和突变型家蚕中分别进行基因克隆、序列比对和表达模式分析,并对 BmADAR的选择性拼接进行研究,鉴定了不同转录本的表达谱特征和可能的自我编辑位点。本文主要获得如下研究结果: (1)基因克隆及序列分析表明BmGTPCHIa和BmGTPCHIb编码的氨基酸序列在p50和U12(Sel/+)之间均没有差异。不同发育阶段BmGTPCHIb的表达模式在两品系间基本一致,组织表达模式的差异主要在马氏管。BmGTPCHIb在Sel突变体的马氏管不表达,与p50之间存在显著差异,该基因在马氏管的功能是否影响Sel突变表型的形成尚需进一步研究探明。 (2)基因克隆及序列分析表明BmPBGD编码的氨基酸序列在p50和U12(Sel/+)之间有4个氨基酸位点差异,但F2代分离个体的测序结果表明该4个位点并没有与Sel连锁。p50和U12(Sel/+)的BmPBGD在不同发育时期的表达模式基本相同,然而,该基因5龄幼虫不同组织的表达模式在两品系之间多处存在明显差异。Sel突变体在头部较高表达BmPBGD是否为该突变体内脱氨酶活性高于正常蚕的原因尚待深入研究。 (3)利用RT-PCR和RACE首次全面克隆并获得了BmADAR的多种转录类型,成功获得了2个具有完整ORF序列的转录本和4个没有终止密码子的转录本,分别编码氨基端或羧基端各有差异的6种亚型。4个没有终止密码子的转录本的共同特征是在终止密码子TAG处发生了A-to-I的自我编辑。2个具有完整ORF的转录本的基因结构分析说明,BmADAR mRNA在成熟的过程中发生了选择性拼接。时空表达模式结果表明,家蚕主要表达BmADARa亚型。 (4)家蚕基因组数据库信息的查询结果显示,BmADARa由19个外显子、18个内含子构成,编码717 aa。同源序列比对及保守性分析表明,BmADARa和果蝇等昆虫 ADAR一样,属于脊椎动物 ADAR2的同系物。据报道利用原核表达系统表达纯化的ADAR不具有酶活性。为了研究BmADARa的酶活性特点,我们进行了该酶蛋白的原核表达研究,有助于今后对该酶进行大量表达、纯化和鉴定体外酶活特性。 综上,BmADAR在Sel突变体里的基因转录表达模式有待于进一步研究鉴定,目前尚不能排除BmGTPCH、BmPBGD以及BmADAR与Sel之间存在相关性。因为非翻译区的突变,特别是启动子的活性区域的变化,也可能引起基因功能发生异常导致突变体表型的产生。为了确定Sel的基因本质,今后可以通过定位克隆技术对其进行精细定位,从染色体图位上锁定候补基因。本文在BmADAR研究方面取得的结果对于深入解析家蚕BmADAR的A-to-I RNA编辑机制及其与靶标基因dsRNA的相互作用机理提供了必要的理论研究基础。