目的探讨羧甲基赖氨酸通过USP10-AMPKα信号调节斑块内血管平滑肌细胞成骨分化的相关机制。方法1.体外实验:采用组织贴块法分离雄性C57BL/6小鼠主动脉血管平滑肌细胞（Vascualr smooth muscle cells,VSMCs）并培养,利用高糖及成骨培养基模拟糖尿病血管钙化微环境。（1）首先,明确羧甲基赖氨酸（Nε-carboxymethyl lysine,CML）在调控VSMCs成骨分化中的作用,外源性给予CML刺激,分为3组:对照组（Control组）、钙化诱导组（OM组）、CML刺激组（CML组）。通过Western blot、Von Kossa染色及钙含量分析明确CML对血管平滑肌细胞成骨样分化及钙盐沉积的影响,并采用Western blot实验、RT-qPCR技术及免疫荧光染色分析VSMCs中泛素-特异性蛋白酶10（Ubiquitin-Specific peptidase 10,USP10）表达水平与钙化程度的关系。（2）其次,探究去泛素化酶USP10在CML影响VSMCs成骨分化中的作用。使用小干扰RNA（Small interfering RNA,si RNA）或质粒分别沉默或过表达USP10,分组如下:si RNA对照组（si-NC组）、USP10沉默组（si USP10组）、质粒对照组（pc-NC组）、USP10过表达组（pc USP10组）。成骨培养基联合CML干预七天后,采用Western blot法分析VSMCs成骨表型Runx2、BMP2及收缩表型α-SMA表达水平变化,利用Von Kossa染色、茜素红染色法、钙含量测定评估钙化程度。（3）最后,为明确去泛素化酶USP10是否通过腺苷单磷酸活化蛋白激酶α（AMP activated protein kinaseα,AMPKα）信号影响VSMCs成骨分化及钙盐沉积,在过表达USP10的基础上,进一步利用化合物C（Compound C）抑制AMPK通路,分为以下4组:对照组（Control组）、USP10过表达组（pc USP10组）、AMPK抑制组（Compound C组）、双干预组（pc USP10+Compound C组）。通过Western blot、Von Kossa染色、茜素红染色以及钙含量分析评估VSMCs的成骨分化及钙盐沉积。2.体内实验:6-8周龄的雄性ApoE-/-小鼠连续5天腹腔注射链脲佐菌素（Streptozocin,STZ;40mg/kg/day）以构建糖尿病模型。两周后复测血糖,将血糖浓度＞300 mg/dl的小鼠纳入糖尿病组,连续高脂饲料喂养构建糖尿病动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）模型。（1）首先,观察CML对斑块内钙化形成的影响,分组如下:对照组（高脂饮食）、糖尿病AS模型组（STZ腹腔注射+高脂饮食）、CML组（CML尾静脉注射+STZ腹腔注射+高脂饮食）。PBS组织灌注观察小鼠主动脉大体原位观,HE染色观察血管斑块形态,Von Kossa染色、钙含量测定以及血清碱性磷酸酶活性检测评估血管钙化情况。免疫组织化学染色显示去泛素化酶USP10的定位及表达情况。（2）为进一步明确去泛素化酶USP10在CML调控斑块内钙化演进中的作用,分组如下:AAV-NC组（CML+高脂饮食+AAV-vector尾静脉注射）,AAV-USP10组（CML+高脂饮食+AAV-USP10尾静脉注射）。通过组织灌注观察主动脉原位大体观,HE染色观察血管斑块形态,Von Kossa染色、钙含量测定及血清碱性磷酸酶活性实验判断斑块内钙化程度。结果（1）糖尿病微环境下,CML促进VSMCs的成骨样分化及钙盐沉积。（2）随着钙化程度的加重,小鼠VSMCs中去泛素化酶USP10的蛋白及RNA水平均逐渐减少。（3）沉默USP10后,VSMCs的成骨基因Runx2及BMP2表达明显升高,收缩表型α-SMA表达显著降低,钙盐沉积明显增多。相反地,过表达USP10后,VSMCs成骨基因Runx2及BMP2表达降低,收缩表型α-SMA表达增高,钙盐沉积减少。（4）USP10可以与AMPKα相互作用,并通过发挥去泛素化作用影响AMPKαThr172位点的磷酸化,进而调控AMPK信号通路的激活。（5）在过表达USP10的基础上,利用Compound C抑制AMPK信号通路可以逆转过表达USP10对血管平滑肌细胞成骨分化及钙盐沉积的抑制作用。（6）与对照组及糖尿病AS模型组相比,CML组明显促进小鼠主动脉钙盐沉积,且斑块内去泛素化酶USP10表达水平降低。（7）与病毒空载体对照组相比,小鼠过表达USP10后主动脉动脉粥样斑块面积及钙盐沉积均显著减少。结论USP10-AMPKα信号参与羧甲基赖氨酸调控斑块内平滑肌细胞成骨分化。