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【背景与目的】 乙型肝炎是一个危害人类健康的全球性问题,它可引起慢性肝病,患者死于肝硬化和肝癌的风险极高。虽然病毒感染可影响男性生育力,但迄今为止,关于乙肝病毒(HBV)感染对精子功能的影响及其确切的分子机制人们知之甚少。本项目研究乙肝病毒S蛋白(HBs)对人精子中发生的早期凋亡事件和精子受精能力的影响,目的在于了解凋亡与精子受精能力间的关系,揭示HBs影响男性生育力的分子机制。 【材料与方法】 1.材料 (1)乙肝病毒S蛋白(hepatitis B virus surface protein,HBs)。 (2)健康男性精液标本,经知情同意后取自健康男性自愿者。 (3)废弃人卵母细胞,经知情同意后取自临床体外受精术患者。 (4)实验用试剂与培养基。 2.方法 人精子经0、25、50、100μg/mlHBs处理后,用下列方法检测HBs对人精子凋亡和受精能力的影响。 (1)用钙荧光指示剂染色法(the fluo-4 AM calcium assay)检测精子细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的变化。 (2)用钙黄绿素/钴离子荧光染色技术(the Calcein/Co2+assay)检测精子线粒体膜通透转运孔的开放状态。 (3)用蛋白分离与ELISA技术(the protein extraction and ELISA,)分别检测人精子线粒体组分和胞浆组分中细胞色素C(cyt c)的含量。 (4)用ADP∕ATP比值测定技术(the ADP/ATP ratio assay)检测人精子中的ADP/ATP比值。 (5)用计算机辅助精子分析(computer assisted sperm analysis,CASA)技术检测人精子运动参数。 (6)用人精子与卵透明带体外结合试验检测人精子与卵透明带结合的能力。 (7)用豌豆凝集素荧光标记(PSA-FITC)染色技术检测卵透明带诱发精子顶体反应的能力。 【结果】 人精子经0、25、50、100μg/mlHBs分别处理3h,各组结果依次如下。 (1)各组平均[Ca2+]i依次为502.32±135.25,748.06±249.27,1171.11±189.12和1673.94±223.02nmol/106sperm;随HBs浓度增加而上升。HBs50、100μg/ml组的平均[Ca2+]i与对照组的相比,差异非常显著(P<0.01)。 (2)各组钙黄绿素平均荧光强度(FI)依次为433.59±119.47,356.06±96.87,291.64±80.31和214.66±73.7,随HBs浓度增加而下降。各实验组钙黄绿素的平均荧光强度与对照组的相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。 (3)各组精子线粒体组分中的细胞色素C(cytc)平均含量依次为124.95±10.47,109.69±9.17,89.58±10.78和74.44±11.16ng/mg,随HBs浓度增加而下降;精子胞浆组分中的cytc平均含量依次为5.04±1.52,13.01±2.5,27.73±6.75和49.66±8.12ng/mg,随HBs浓度增加而上升。无论是线粒体组分还是胞浆组分,对照组与各实验组间cytc含量的差异均有统计学意义(P<0.05;P<0.01)。 (4)各组ADP/ATP的平均比值依次为0.04±0.02,0.27±0.05,0.48±0.04和0.83±0.05,随HBs浓度增加而上升。对照组与各实验组间,ADP/ATP平均比值的差异非常显著(P<0.01)。 (5)各组精子的平均活率(％)依次为85.80±4.04,82.40±3.42,73.40±3.59和65.40±3.09,随HBs浓度增加而下降。HBs50和100μg/ml组的平均活率与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.01)。 (6)各组精子平均超激活率(%)依次为45.00±11.00,36.00±8.00,30.00±6.00和19.00±4.00,随HBs浓度增加而下降。各实验组精子平均超激活率与对照相比,差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.01)。 (7)各组精子平均运动速度随HBs浓度增加而下降。 (8)各组卵透明带诱发的精子顶体反应(ZPIAR)平均百分率(%)依次为38.36±8.73,28.57±11.76,18.99±6.84和10.98±3.58,随HBs浓度增加而下降。各实验组ZPIAR的平均百分率与对照组间的差异显著或非常显著(P<0.05;P<0.01)。 上述各实验组,HBs的效应均具有剂量依赖关系。 HBs处理各组结合到卵透明带上的精子数目与对照组的差异没有统计学意义(P>0.05) 【结论】 HBs可诱发人精子细胞内Ca2+超载、MPTP不可逆开放、cyt-c从线粒体释放入胞浆,导致线粒体功能受损,ADP/ATP比值下降,触发一系列早期凋亡级联事件;同时HBs可引起精子活率、超激活率、运动速率和卵透明带诱发的精子顶体反应能力下降,表明HBs可通过凋亡影响线粒体的功能进而影响精子的受精能力。