免疫性肝损伤以肝脏组织免疫应答异常和炎症为特征,可存在于病毒性肝炎、原发性胆道胆管炎和自身免疫性肝炎等常见肝脏疾病中。如未得到有效控制,免疫性肝损伤可进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。现有研究表明,免疫性肝损伤的病理过程与氧化应激、一氧化氮（NO）和炎性因子等密切相关。肝脏受损的同时,多种药物代谢酶和转运体的表达会发生变化,从而导致药物在体内的分布、代谢和排泄等生物转化过程异常。羧酸酯酶（CESs）是重要的I相药物代谢酶,其中CES1和CES2是人体肝脏中含量和表达较为丰富的两种主要亚型,可介导多种药物、内源性物质以及有机磷农药水解,并且在维持糖代谢平衡、脂质稳态中发挥重要作用。本研究旨在评价免疫性肝损伤模型中CES1和CES2的表达和活性变化,并从氧化应激、一氧化氮（NO）和炎性细胞因子角度深入探讨CESs下调的机制,以期为临床免疫性肝损伤患者的安全合理用药提供一定的理论依据。第一部分:免疫性肝损伤小鼠肝脏CESs表达和活性变化目的:评价免疫性肝损伤小鼠肝脏组织CESs的表达和活性变化。方法:采用8周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分为Control组和LPS组,通过小鼠尾静脉注射卡介苗（BCG）和脂多糖（LPS）建立免疫性肝损伤模型,分别于0 h、4h、8 h、12 h、和16 h处死动物。测定小鼠肝重比、脾重比、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）,取肝脏组织进行HE染色、油红O染色和ROS染色。采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）和Western blotting技术测定小鼠肝脏组织中CES1和CES2的m RNA和蛋白表达水平。同时,采用高效液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）方法测定小鼠肝微粒体孵育体系中CES1和CES2的特异性底物氯吡格雷和伊立替康代谢产物的含量考察CES1和CES2的活性。结果:与Control组相比,LPS组小鼠肝重比、脾重以及血清ALT、AST水平显著升高。HE染色结果显示LPS组小鼠肝脏发生明显的肝细胞结构破坏或坏死,炎性细胞浸润等病理损伤变化;ROS染色和油红O染色结果显示LPS组小鼠肝脏存在氧化应激和脂质沉积;同时,LPS组小鼠肝脏中CES1和CES2的m RNA和蛋白表达水平显著下降。与Control组相比,LPS组小鼠肝微粒体中氯吡格雷和伊立替康的代谢产物生成速率显著降低,CES1和CES2的代谢活性显著下降。结论:免疫性肝损伤小鼠肝脏CES1和CES2的表达和活性显著降低。第二部分:基于氧化应激和一氧化氮探讨免疫性肝损伤小鼠肝脏CESs下调的机制目的:从氧化应激和一氧化氮（NO）的角度初步探究免疫性肝损伤小鼠肝脏CESs下调的机制。方法:检测免疫性肝损伤小鼠肝脏组织中NO水平以及氧化应激损伤相关因子丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的含量。培养小鼠原代肝细胞和人Hepa RG细胞,采用H2O2或谷胱甘肽合成酶抑制剂丁硫氨酸-亚砜亚胺（BSO）诱导氧化应激,或给予细胞NO供体二亚乙基三胺（DETA）刺激,通过PCR和Western blotting分别检测细胞中CES1和CES2的m RNA和蛋白表达水平,并采用分光光度法测定CESs底物对硝基苯乙酸酯的水解速率来检测细胞CESs的活性。以尾静脉注射BCG和LPS建立免疫性肝损伤小鼠模型,腹腔注射抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）,检测小鼠肝重比、脾重比、ALT和AST水平以及ROS水平,并通过测定肝脏中CESs的表达和活性（方法同第一部分）,评价氧化应激对于免疫性肝损伤小鼠肝脏CESs的作用。结果:与Control组相比,BCG和LPS处理的LPS组小鼠肝脏中NO水平显著升高,氧化应激损伤相关因子ROS和MDA的水平显著升高,GSH-PX、SOD的活性显著下降;小鼠原代肝细胞和Hepa RG细胞在经DETA处理后,CES1和CES2的表达和活性水平差异无统计学意义。H2O2和BSO诱导的氧化应激抑制了细胞CES1和CES2的表达和活性。然而,体内给予小鼠抗氧化剂NAC无法逆转免疫性肝损伤小鼠肝脏CESs表达和活性的下调。结论:免疫性肝损伤小鼠肝脏CES1和CES2的表达和活性的下调与氧化应激和NO无关,CESs下调的机制有待进一步研究。第三部分:IL-33下调免疫性肝损伤小鼠肝脏CESs的作用和机制研究目的:基于炎性细胞因子角度探讨免疫性肝损伤小鼠肝脏中CESs下调的作用和相应机制。方法:采用RT-PCR法检测免疫性肝损伤小鼠肝脏组织中炎性细胞因子的m RNA表达水平,通过免疫组化法进一步测定肝脏IL-33的表达;采用IL-33敲除（IL-33KO）动物,以尾静脉注射BCG和LPS建立免疫性肝损伤模型,检测小鼠肝重比、脾重比和血清ALT、AST水平,并取肝脏组织进行HE染色检测其病理变化。测定肝脏中CESs的表达和活性（方法同第一部分）,评价敲除IL-33是否逆转免疫性肝损伤小鼠肝脏CESs的表达和活性的下调。以5、10和20 ng/m L的IL-33刺激小鼠原代肝细胞,通过RT-PCR和Western blotting检测细胞中CES1和CES2的表达。通过流式细胞计数和免疫组化法测定免疫性肝损伤小鼠体内淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的表达,然后以20 ng/m L的IL-33处理RAW264.7巨噬细胞,24 h后收集细胞上清液提取外泌体,并以透射电镜、纳米颗粒追踪分析技术和Western blotting方法对外泌体进行鉴定。将PKH26标记的外泌体与鬼笔环肽标记的小鼠原代肝细胞共培养,通过免疫荧光共聚焦观察外泌体是否被小鼠原代肝细胞摄取,并以Western blotting测定经外泌体处理后小鼠原代肝细胞CES1和CES2的蛋白表达水平。结果:与Control组相比,免疫性肝损伤模型小鼠肝脏中IL-33的基因和蛋白表达水平显著升高;与野生型小鼠（WT+LPS组）相比,IL-33 KO小鼠接受BCG和LPS造模后,小鼠肝重比、脾重比、血清ALT和AST水平明显降低,肝细胞坏死和炎性细胞浸润得到缓解,并逆转了CES1和CES2表达水平和代谢活性的下调。然而,体外研究发现不同浓度的IL-33单独刺激小鼠原代肝细胞并不影响其CES1和CES2的表达水平。流式和免疫组织化学结果显示免疫性肝损伤模型小鼠肝脏的巨噬细胞显著增多,且经20 ng/m L的IL-33处理的RAW264.7巨噬细胞分泌的外泌体可被小鼠原代肝细胞摄取,并显著抑制小鼠原代肝细胞中CES1和CES2的蛋白水平。结论:免疫性肝损伤小鼠异常升高的IL-33可能通过巨噬细胞外泌体作用于肝细胞,进而下调CES1和CES2的表达和活性。