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目的:矿物粉尘诱导基因mdig作为一种新发现的肺癌相关基因,具有促进肿瘤细胞增殖的作用。脉管（血管与淋巴管）新生在肿瘤的发生发展过程中起关键作用。随着肿瘤细胞迅速增殖,瘤体内部形成局部低氧微环境,进一步刺激肿瘤的脉管生成。其中,VEGF家族是调控肿瘤脉管新生最为重要的蛋白之一。因此,本实验旨在探讨mdig能否调控VEGF家族的蛋白表达,进而影响非小细胞肺癌脉管的生成。研究方法:研究的第一部分:探讨不同氧气环境对mdig与脉管生成相关蛋白的调控机制。实验中将A549、H1299和293T细胞株分别在正常氧气（37℃,21%O2,5%CO2）和低氧（37℃,1%O2,5%CO2）环境中培养24小时,应用western blot检测mdig、EGFR、HIF-1α和VEGF-A/C/D蛋白的表达差异。研究的第二部分:探讨mdig调控脉管生成相关蛋白的分子机制。实验中通过慢病毒载体构建mdig过表达的A549、H1299和293T稳定转染细胞系,以及mdig沉默的A549稳定转染细胞系,分别在常氧和低氧条件下进行培养。稳定转染的三组细胞系培养并传代至少4次后,根据western blot和RT-q PCR验证mdig的转染效果。同时,获取常氧和低氧环境中培养的A549与H1299两组稳转细胞系的条件培养液,培养人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）和人淋巴管内皮细胞（HLEC）。应用western blot方法检测A549、H1299和293T稳转细胞系中EGFR、p-EGFR（Tyr1068）、HIF-1α和VEGF-A/C/D的蛋白表达,及其条件培养液培养的HUVEC细胞株中VEGF受体VEGF-R1/R2的蛋白水平、HLEC细胞株中VEGF-R3的蛋白水平。使用RT-q PCR方法检测常氧和低氧条件下培养的三组稳转细胞系中EGFR和HIF-1α的m RNA水平。根据蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）实验检测mdig分别与EGFR和HIF-1α在蛋白质之间的直接作用关系。利用核质蛋白分离实验检测mdig对HIF-1α在细胞内的表达水平和分布的影响。最后利用体外基质胶成管实验和裸鼠成瘤实验验证mdig对肿瘤生长及非小细胞肺癌脉管生成的调控。研究的第三部分:探讨mdig调控脉管生成的信号通路。实验中通过对常氧和低氧环境培养的mdig过表达的A549稳转细胞系予以EGFR信号通路抑制剂,对mdig沉默的A549稳转细胞系予以EGFR信号通路激动剂,并应用western blot方法检测EGFR、p-EGFR（Tyr1068）和VEGF-A的蛋白水平,裸鼠成瘤实验检测EGFR抑制剂处理后的mdig过表达组A549细胞对肿瘤生长及血管生成的影响,以探讨mdig调控非小细胞肺癌血管生成的信号通路。同时,通过对mdig过表达的A549稳转细胞系予以HIF-1α信号通路激动剂,对mdig沉默的A549稳转细胞系予以HIF-1α信号通路抑制剂,根据western blot实验检测HIF-1α、VEGF-C和VEGF-D的蛋白表达,裸鼠成瘤实验检测HIF-1α激动剂处理后的mdig过表达组A549细胞对淋巴管生成的影响,以探讨mdig调控非小细胞肺癌淋巴管生成的信号通路。结果:氧气浓度对mdig和脉管生成相关蛋白的调控:western blot实验检测常氧和低氧中培养的A549、H1299和293T细胞系中,mdig、EGFR、HIF-1α和VEGF-A/C/D蛋白的基础表达,结果发现低氧条件下EGFR、HIF-1α和VEGF-A/C/D的蛋白水平均较常氧明显升高,而mdig的蛋白水平较常氧明显下降。mdig对脉管生成相关蛋白的调控:应用慢病毒载体转染构建A549、H1299和293T稳转细胞系,并分别在常氧和低氧条件下进行培养,应用western blot和RT-q PCR检测mdig的过表达和沉默效果。结果发现mdig过表达组的A549、H1299和293T稳转细胞系中,mdig m RNA和蛋白水平均较对照LV-con组明显升高;在mdig沉默组的A549稳转细胞系中,mdig m RNA和蛋白水平较对照LV-mdig-RNAi-con组明显下降。通过western blot实验检测三组稳转细胞系中EGFR、p-EGFR（Tyr1068）、HIF-1α和VEGF-A/C/D,以及条件培养液培养的HUVEC、HLEC细胞系中VEGF-R1/R2/R3的蛋白表达,结果发现mdig过表达组的EGFR、p-EGFR（Tyr1068）和VEGF-A/R1/R2的蛋白水平与对照LV-con组相比明显升高,而HIF-1α和VEGF-C/D/R3的蛋白量与对照LV-con组相比,却明显降低。且在mdig沉默的A549稳转细胞系中,上述结果完全相反。另外,为了探讨mdig对EGFR和HIF-1α之间的分子机制,本研究应用RT-q PCR实验检测上述三组稳转细胞系中mdig分别对EGFR和HIF-1αm RNA的调控作用,结果显示不论在常氧或低氧条件下,mdig m RNA分别与EGFR和HIF-1α的m RNA之间均无显著性差异。随后,本研究使用Co-IP实验检测mdig分别与EGFR和HIF-1α在蛋白水平上的直接相互影响,结果显示mdig与后两者的蛋白质之间无直接结合作用。为了探讨mdig对HIF-1α蛋白具有反常抑制作用的机制,本研究利用核质蛋白分离实验检测mdig对HIF-1α在细胞内的表达和分布的影响,结果表明mdig抑制HIF-1α从细胞质向细胞核转移。在体外基质胶成管实验中,从mdig过表达A549稳转细胞系提取的条件培养基培养的HUVEC细胞血管生成密度明显多于从对照组提取的条件培养基培养的HUVEC细胞血管生成密度;且从mdig过表达组条件培养基培养的HLEC细胞淋巴管生成密度明显少于从对照组。最后,在体内实验中,mdig过表达A549稳定转染细胞系在裸鼠皮下形成的肿瘤体积在种植3周后明显大于对照LV-con组,但mdig沉默组细胞系均未成瘤。根据成瘤组织的免疫组化实验对脉管以及VEGF家族进行染色,结果发现mdig过表达组血管新生的密度明显多于对照LV-con组,而且mdig和VEGF-A表达也较LV-con组相比明显增强,但淋巴管新生的密度及VEGF-C/D的表达却明显降低。mdig调控脉管生成的信号通路:通过对常氧和低氧条件下培养的mdig过表达的稳转细胞系予以EGFR抑制剂后,应用western blot检测EGFR、p-EGFR（Tyr1068）和VEGF-A的蛋白水平,结果显示加药组的EGFR、p-EGFR（Tyr1068）和VEGF-A的蛋白表达较mdig过表达组明显下降,但对常氧和低氧条件下培养的mdig沉默的A549稳转细胞系予以EGFR激动剂后,上述指标较mdig沉默组明显增高。裸鼠成瘤实验显示,对mdig过表达的稳转细胞系予以EGFR抑制剂后,肿瘤体积及新生血管密度也显著减小。同样,通过对mdig过表达的稳转细胞系予以HIF-1α的激动剂后,应用western blot检测HIF-1α和VEGF-C/D的蛋白水平,结果显示加药组的HIF-1α和VEGF-C/D蛋白表达量与mdig过表达组相比明显上升,但对mdig沉默的A549稳转细胞系予以HIF-1α抑制剂后,上述指标与mdig沉默组相比明显下降。裸鼠成瘤实验显示,对mdig过表达的稳转细胞系予以HIF-1α的激动剂后,新生淋巴管密度显著增多。结论:1.mdig是一种氧敏感蛋白,其表达水平与氧浓度有关,低氧抑制mdig的表达。2.mdig促进肿瘤生长,可以导致肿瘤血管新生。且无论是在常氧还是低氧环境中,mdig均是EGFR和HIF-1α的上游基因,midg促进EGFR却抑制HIF-1α蛋白的表达及入核,而且mdig对EGFR和HIF-1α的调控发生在翻译或翻译后修饰过程。3.mdig通过促进EGFR/p-EGFR（Tyr1068）/VEGF-A/VEGF-R1/R2通路活化导致肿瘤血管新生,而通过抑制HIF-1α/VEGF-C/D/VEGF-R3通路导致肿瘤淋巴管新生受阻。