前言:软骨肉瘤是一种比较常见的恶性骨肿瘤,约占全部原发恶性骨肿瘤的9.2%,发病率仅次于骨肉瘤,平均发病年龄在50岁左右,男性略多于女性（55%:45%）。软骨肉瘤包括多种亚型,其中传统型/经典型软骨肉瘤约占85%,其它亚型包括去分化型、透明细胞型、皮质旁型、黏液型、间叶型软骨肉瘤及恶性软骨母细胞瘤。传统型软骨肉瘤的5年生存率约为70%,广泛手术切除肿瘤是目前的主要治疗方法,因肿瘤基质丰富、血运匮乏,化疗和放疗对其效果不敏感。当肿瘤位于颅底、骶骨等不可手术切除的部位或术后肿瘤切缘阳性时可考虑进行放射治疗。125I放射性粒子组织间植入是近距离放疗的一种,目前已被广泛应用于临床治疗前列腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、头颈癌、淋巴结转移癌等多种恶性肿瘤,但对肉瘤相关的研究较少,应用125I放射性粒子组织间植入治疗软骨肉瘤的文献更加罕见。截止至2021年2月,我们在中国知网、万方数据库与Pubmed上以“125I粒子(125I seed)和软骨肉瘤（chondrosarcoma）”为主题词进行检索,只查到3篇文献报道,其中的1篇是以本文实验研究结果发表的论文,另外2篇均为临床报道。一篇文章的作者对一例椎体低级别传统型软骨肉瘤术后复发的病例进行了再次手术,术中对肿瘤进行了边缘性的切除,同时在瘤床植入125I放射性粒子进行辅助治疗,随访两年肿瘤无复发;另一篇作者报道了对5例脊柱软骨肉瘤术后复发的病例应用125I放射性粒子植入治疗,随访15.2个月（2～41个月）,术后疼痛明显得到改善,镇痛有效率100%,1年肿瘤的局部控制率为60%。这两篇临床报道似乎为无法手术广泛切除的软骨肉瘤患者提供了一种有效的治疗方法。125I放射性粒子释放的γ射线可以引起多种恶性肿瘤细胞DNA发生断裂、细胞坏死,同时还可抑制细胞的增殖、促进细胞的凋亡,但对软骨肉瘤的生长、细胞的增殖以及凋亡具有何种影响目前尚无相关报道。因此,我们设计了一种新的体外125I放射粒子照射模型,用来研究125I放射粒子照射对软骨肉瘤细胞增殖、侵袭、转移和凋亡的影响;再通过建立人软骨肉瘤SW1353裸鼠移植瘤模型,对肿瘤植入粒子后进行相关的研究,旨在进一步明确125I放射性粒子植入软骨肉瘤后对肿瘤的作用;最后进行了miRNA表达谱分析,并对miRNAs-mRNAs调控网络进行了综合分析、验证,为揭示125I粒子放射性粒子植入治疗软骨肉瘤的机制奠定基础,也为临床的治疗提供理论依据。目的:1.评价125I放射性粒子对人软骨肉瘤细胞的作用2.评价125I放射性粒子对人软骨肉瘤裸鼠移植瘤的影响3.探索125I放射性粒子对人软骨肉瘤细胞的作用机制4.为125I放射性粒子临床应用治疗软骨肉瘤及对其进一步的深入研究提供理论依据和参考。研究方法:1.125I放射性粒子体外照射模型的建立。2.125I放射粒子模型进行体外照射人软骨肉瘤细胞。3.MTT法测定细胞活力并绘制细胞生长曲线。4.利用克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell实验以及TUNEL实验对人软骨肉瘤细胞的增殖能力、迁移侵袭能力和凋亡情况进行分析研究。5.构建SW1353人软骨肉瘤裸鼠移植瘤模型。6.模型构建成功后,在移植瘤内植入粒子,评价125I放射性粒子对裸鼠移植人软骨肉瘤增长的影响。利用HE染色与免疫组化等方法评价125I放射性粒子对肿瘤组织坏死、增殖、凋亡的作用。7.提取经6Gy 125I放射性粒子照射的SW1353细胞RNA,利用生物信息学分析技术对细胞差异表达的miRNAs进行分析,并预测其调控的mRNA,找出与本实验结果相关的miRNAs和mRNA并进行实验验证。8.确定125I放射性粒子照射人软骨肉瘤细胞后引起细胞凋亡增加的关键miRNA,将转染miRNA特异性mimic NC、mimic、inbibitor NC、inbibitor的各组细胞进行增殖、侵袭、迁移和凋亡相关的研究,进一步确定关键miRNA对人软骨肉瘤的作用。9.提取转染后的SW1353细胞RNA并对转录组进行测序、生物信息学分析以及实验验证,找出差异表达的靶基因。10.利用荧光实时定量PCR、Western Blot等实验方法进一步验证,确定筛选出的差异表达靶基因,明确125I放射性粒子照射人软骨肉瘤细胞后引起肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡改变的部分机制。结果:1.125I放射性粒子照射对人软骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响结果。（1）SW1353细胞和CAL78细胞暴露于2 Gy总辐射剂量之后的2天内,细胞生长变得不稳定,从第2天到第7天,细胞生长抑制的百分比逐渐增加。暴露于4 Gy辐射总剂量的SW1353细胞和CAL78细胞,从暴露后的第1天到第7天,细胞生长抑制作用逐渐增加。然而,在6 Gy和8 Gy组中的SW1353细胞和CAL78细胞的生长抑制几乎是照射瞬间就发生了,从照射后的第1天起细胞的生长即受到显著抑制。随着辐射剂量从6 Gy增加到8 Gy,细胞生长抑制的百分比也逐渐增加,在暴露后7天达到最高值。照射后的第7天,暴露于2、4、6、8 Gy组辐射总剂量的SW1353细胞的生长抑制率分别为14.64%,17.25%,22.41%和26.39%,CAL78细胞的生长抑制率分别为12.30%,15.25%,24.08%和28.39%（P<0.05）。（2）暴露于6 Gy总照射剂量的实验组SW1353细胞和CAL78细胞与正常对照组细胞相比,24 h的细胞迁移率均显著降低（P<0.05）。暴露于6 Gy辐射总剂量的SW1353细胞的迁移率为44.67%,CAL78细胞的迁移率为31.0%。（3）暴露于6 Gy总照射剂量的实验组SW1353细胞和CAL78细胞与正常对照组细胞相比,细胞穿过铺有Matrigel基质胶的Transwell小室基底膜的数量均明显减少,细胞侵袭性显著下降（P<0.05）。（4）TUNEL实验结果显示,实验组的部分细胞发生了凋亡,呈现出细胞核碎裂、空洞、DNA断裂等异常表现。与对照组细胞相比,实验组的部分细胞发生了凋亡,呈现出细胞核碎裂、空洞、DNA断裂等异常表现。对照组SW1353和CAL78细胞的凋亡率均为0.33%,而实验组SW1353细胞的凋亡率为25.21%,实验组CAL78细胞的凋亡率为15.03%。暴露于6 Gy总照射剂量的实验组SW1353细胞和CAL78细胞与正常对照组相比,Bcl-2表达量显著下降,Bax和cleaved caspase-3的表达无显著差异,cleaved caspase-9的表达量显著升高,两株细胞的变化趋势一致。2.125I放射性粒子植入SW1353人软骨肉瘤裸鼠移植瘤后,对肿瘤生长的影响,以及对细胞的增殖和凋亡的影响。（1）125I放射性粒子植入对裸鼠人软骨肉瘤移植瘤的生长抑制作用明显,在粒子植入术后15d,实验组与对照组肿瘤平均体积增长率分别为8.81%和391.5%。（2）125I放射性粒子植入术后15天将实验组与对照组裸鼠分别以颈椎脱臼法处死,剥离肿瘤后进行称重,实验组肿瘤重量明显小于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）,经计算125I放射粒子对SW1353裸鼠移植瘤TIR为80.83%。（3）HE染色后镜下观察,实验组肿瘤细胞病理核分裂象少于对照组,肿瘤坏死率在实验组TNR 5～20%,对照组TNR 0～1%,两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）免疫组化染色后进行评价分析,实验组Ki-67阳性率约31%,对照组Ki-67阳性率约54%,两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。实验组caspase-9的表达水平高于对照组,Bcl-2的表达水平低于对照组,两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。125I放射粒子对软骨肉瘤SW1353细胞的促凋亡蛋白caspase-9表达具有促进作用,对Bcl-2凋亡抑制蛋白的表达具有抑制作用。3.125I放射性粒子照射SW1353人软骨肉瘤细胞后miRNAs的变化以及验证结果。（1）暴露于6 Gy辐射剂量的SW1353细胞,微阵列分析共鉴定出2549个miRNA。与对照组相比,有189个差异表达的miRNA（P<0.05）,包括98个上调的miRNA和91个下调的miRNA。聚类直方图显示了照射组和对照组之间不同的miRNA表达谱,并且热图显示了照射组和未照射组之间前15个差异表达的miRNA。（2）使用Target Scan,PITA和miRNA.org数据库预测相关的miRNA靶基因。我们选择了三个数据库的交集进行靶基因预测,然而只有3个miRNA（miR-1224-5p,miR-492和miR-135b-5p）在交集中具有靶基因。通过生物信息学分析以及实验验证。根据KEGG数据库,我们确定了预测靶基因的前20条重要通路,通过STRING构建了预测靶基因的PPI网络,并通过Cytoscape对其进行了可视化。通过筛选,共发现299个必需基因。此外通过MCODE对整个PPI网络进行分析,结果表明这些基因比网络中研究较少的基因具有更多的相互作用。这些关键基因主要包括VEGFA、MAPK1、CUL3、HNRNPA1和PPP1CC。（3）鉴于miRNA序列互补性预测的靶基因可能导致假阳性结果,因此,我们根据微阵列、通路和PPI网络分析结果,对10个miRNA和10个预测的靶基因分别进行了3次q RT-PCR实验验证。结果表明,我们验证的70%（7/10）基因与微阵列分析的表达趋势一致。在选择验证的10个miRNA中,miR-4689、miR-6076和miR1469的表达水平与微阵列分析结果不一致,但差异并不明显。4.125I放射性粒子照射人软骨肉瘤细胞后,miRNAs调控肿瘤细胞增殖、迁移侵袭以及凋亡能力的机制研究结果。（1）为了进一步研究miR-6839-5p对软骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响,我们对SW1353和CAL78人软骨肉瘤细胞转染miR-6839-5p mimic NC和miR-6839-5p mimic后进行MTT、克隆形成、划痕、Transwell和TUNEL实验,结果表明转染miR-6839-5p mimic的实验组SW1353和CAL78细胞与正常对照组细胞相比,细胞增殖、迁移能力均显著降低（P<0.05）,实验组SW1353和CAL78细胞与正常对照组细胞相比,细胞穿过铺有Matrigel基质胶的Transwell小室基底膜的数量明显减少,细胞侵袭性显著下降（P<0.05）。与对照组细胞相比,实验组的部分细胞发生了凋亡,呈现出细胞核碎裂、空洞、DNA断裂等异常表现。转染miR-6839-5p mimic的实验组SW1353细胞和CAL78细胞与转染miR-6839-5p mimic NC的对照组相比,Bcl-2表达量显著下降,Bax和cleaved caspase-3的表达无显著差异,cleaved caspase-9的表达量显著升高,两株细胞的变化趋势一致。（2）采用edge R软件对转染miR-6839-5p mimic NC的对照组（M1）和转染miR-6839-5p mimic的实验组（M2）SW1353细胞进行差异筛选,转录组分析共鉴定出253个差异表达基因,包括105个上调基因和148个下调基因。聚类直方图显示了M2组和M1组之间不同的基因表达谱,并且热图显示了照射组和未照射组之间差异表达的基因。为了便于找到miR-6839-5p调控的靶基因,我们将转录组筛选鉴定出的148个下调的差异表达基因与Target Scan、miRWalk或miRDB三个数据库预测的结果取交集,找到23个差异表达的下调的靶基因。（3）对转染miR-6839-5p mimic NC的对照组（M1）和转染miR-6839-5p mimic的实验组（M2）SW1353细胞进行了转录组测序和分析,进一步对转染miR-6839-5p mimic的SW1353细胞选定了8个可能的靶基因,并进行了q RT-PCR实验验证。结果表明,在选择验证的8个靶基因中,BST2、VEGFA、FPR3和PPARA的表达显著下调,而miR-6839-5p inhibitor则恢复或者部分恢复了SW1353和CAL78细胞中上述基因的表达。结论:1.125I放射性粒子近距离照射可以抑制人软骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进肿瘤细胞发生凋亡。2.125I放射性粒子植入人软骨肉瘤裸鼠移植瘤后,可以通过抑制肿瘤细胞的增殖,促进其发生凋亡、坏死起到抑制肿瘤生长的作用。3.125I放射性粒子照射SW1353人软骨肉瘤细胞和CAL78细胞后,miR-6839-5p可能通过靶向调控BST2、VEGFA、FPR3和PPARA对SW1353人软骨肉瘤细胞发挥抗肿瘤作用,miR-6839-5p可能是治疗软骨肉瘤的靶点之一。