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日本血吸虫病是由日本血吸虫(Schistosome japonicum)感染所引起的一种严重危害人畜健康的寄生虫病,当前,该病流行于我国南方7省,给疫区人民和动物的健康造成严重威胁。目前还没有有效的血吸虫病疫苗,吡喹酮是唯一大规模使用的治疗药物,筛选疫苗候选分子和新的药物靶标是血吸虫病防治研究的迫切需求。诊断在血吸虫病防治过程中具有重要的作用,而现有的日本血吸虫病诊断方法不能满足诊断需求,因此寻求一种更为敏感、特异,并且具有疗效考核价值的诊断方法也是当前的十分迫切。日本血吸虫的体被是其与宿主相互作用的主要界面,在日本血吸虫的生长发育中具有重要的作用,一些分布于体被上的表膜蛋白是重要的疫苗药物靶标和诊断抗原分子。前期本实验室应用蛋白组学技术系统分析了不同发育时期日本血吸虫体被表膜蛋白,筛选出SjRAD23和SjMBLAC1两个表膜蛋白,推测它们在血吸虫寄生生活中可能起着重要作用。为探讨这两个基因的生物学功能,评估其作为疫苗候选分子的潜力以及诊断抗原的价值,本文开展了以下研究。1日本血吸虫RAD23基因的克隆表达、特征分析及小鼠免疫保护效果评估辐射敏感蛋白23具有核苷酸切除修复功能,在泛素蛋白酶体途径中起致重要作用,是日本血吸虫生长发育不可缺少的蛋白。本研究利用PCR技术克隆日本血吸虫辐射敏感蛋白23(SjRAD23)编码的cDNA序列,其ORF为1053bp。构建了SjRAD23基因重组表达质粒pET28a(+)-SjRAD23,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达,重组蛋白分子量大约44kDa,在上清和沉淀中均有表达。利用免疫组化技术观察该蛋白广泛分布在日本血吸虫虫体被膜。用重组蛋白免疫BALB/C小鼠后,免疫小鼠血清中检测到较高水平的IgG.IgGl和IgG2a特异性抗体。Western blotting分析结果显示重组蛋白能够被日本血吸虫成虫可溶性抗原免疫小鼠血清所识别,表明具有良好的免疫原性。应用重组蛋白rSjRAD23结合佐剂206免疫小鼠与206佐剂对照组比较获得了35.94%减虫率和40.59%肝脏减卵率,说明rSjRAD23在BALB/c小、鼠中诱导产生了部分的免疫保护效果。2日本血吸虫MBLAC1基因的克隆表达、特征分析及小鼠免疫保护效果评估金属β-内酰胺酶(MBL)是一种依赖锌离子的存在而发挥催化活性的酶,其底物涵盖碳青霉烯类等在内的多种β-内酰胺类抗生素。本研究利用PCR技术克隆日本血吸虫金属-β-内酰胺酶结构域蛋白1(MBLAC1)编码的cDNA序列,其ORF为711bp。构建了SjMBLAC1基因重组表达质粒pET28a(+)一SjMBLAC1,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达,重组蛋白分子量大约33kDa,在上清和沉淀中均有表达。利用免疫组化技术观察表明该蛋白广泛分布在日本血吸虫虫体被膜。用重组蛋白免疫BALB/C小鼠后,免疫小鼠血清中检测到较高水平的IgG、IgG1和IgG2a特异性抗体。Western blotting分析结果显示重组蛋白能够被日本血吸虫成虫可溶性抗原免疫小鼠血清所识别,具有良好的免疫原性。重组蛋白rMBLAC1结合206佐剂免疫小鼠与206佐剂对照组比较获得了33.79%减虫率和37.79%的肝脏减卵率。3重组抗原rSjRAD23作为诊断抗原检测家畜日本血吸虫病本文通过方阵试验,优化ELISEA实验条件,以重组抗原rSjRAD23和日本血吸虫可溶性虫卵抗原SjSEA作为诊断抗原,分别检测了60份健康水牛血清和75份感染日本血吸虫病水牛血清以及14份前后盘吸虫感染牛血清和6份大片吸虫感染牛血清,比较两种抗原获得的敏感性、特异性；结果以重组抗原SjRAD23作为诊断抗原,特异性为98.33%；敏感性为89.33%,与前后盘吸虫和大片吸虫吸虫的交叉反应率分别为14.28%和0%。以虫卵可溶性抗原SjSEA作为诊断抗原,特异性为91.67%；敏感性为100%,与前后盘吸虫和大片吸虫吸虫的交叉反应率分别为50%和16.67%。表明以重组抗原SjRAD23作为牛血吸虫病诊断抗原,敏感性略低于SjSEA,但特异性及与其他寄生虫交叉反应性都好于SjSEA。以重组抗原rSjRAD23和日本血吸虫可溶性虫卵抗原SjSEA作为诊断抗原,平行检测了实验兔感染日本血吸虫前,感染日本血吸虫后2周、4周、6周以及用血吸虫病治疗药物吡喹酮治疗后每月兔血清中两种抗原特异性抗体水平,分析兔血清中两种特异性抗体的消长变化,评价两种诊断抗原的疗效考核价值。结果以两种抗原作为诊断抗原,感染后2、4、6周都出现阳性反应,以重组抗原rSjRAD23作为诊断抗原,在吡喹酮治疗后的2个月、3个月、5个月各有一实验兔转阴；而以日本血吸虫可溶性虫卵抗原SjSEA作为诊断抗原,7只实验兔直至治疗后6个月转阴率仍然为0%。表明以重组抗原rSjRAD23作为诊断抗原,比SjSEA有更好的疗效考核价值。