【摘 要】
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为了使大肠杆菌热敏毒素LT的毒素活性消失,同时仍保留其较强的免疫原性,该实验依据LT基因的同源序列设计并合成5条寡核苷酸引物,采用突出末端PCR法和重组PCR法,将克隆于质粒p
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为了使大肠杆菌热敏毒素LT的毒素活性消失,同时仍保留其较强的免疫原性,该实验依据LT基因的同源序列设计并合成5条寡核苷酸引物,采用突出末端PCR法和重组PCR法,将克隆于质粒pEWD299上的LT基因,分别引入BamHI,NdeI和XhoI等位点,扩增出带有上述RE位点且含有m<,7>T m<,112>突变点的约1100bp和约800bp的DNA片段和不含突变点的约300bp的DNA片段,使控制LT毒力活性中心的第7位和第112位氨基酸的碱基分别发生诱变,各DNA片段经分离、纯化、RE酶切和DNA连接酶连接后,插入经BamHI和XhoI双酶切的线性化的高效表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点区,使LTm基因置于pTac强启动子下且与Thrombin蛋白基因融合表达,将连接产物转化入JM105菌株,挑出可疑阳性菌落,提取质粒,经酶切鉴定、PCR鉴定和DNA序列分析,证明读框正确,序列正确,获得了pGEX-4T-1(LTm<,7>)和pGEX-4T-1(LTm<,112>)两个重组表达质粒.
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