目的 本文运用膜片钳技术，采用内面向外式记录方法，研究不同普鲁卡因浓度对皮层锥体神经元胞体上延迟整流型K~+通道的影响，进而探讨普鲁卡因对中枢作用的分子机理。 方法 1神经元的急性分离2～5天龄的SD大鼠，雌雄不限，断头、取脑，掀取项叶皮层并切成薄的脑片，置入去钙、镁人工脑脊液（ACSF）中吹打后，放入含2.5％胰蛋白酶的人工脑脊液中消化。吸取消化后的细胞悬液3～5滴，涂于经多聚赖氨酸处理的盖玻片上，细胞贴壁后入高钾浴槽液中。 2实验分组 普鲁卡因经微量加样器加入，按其浓度分为8个组：0（对照组）、0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mmol/L。每组以7个不同的钳制电压，观察11个样本。 3单通道记录 采用膜片钳技术的内面向外式单通道电流，用电极拉制器两步拉制电阻为10～12MΩ的电极，加热水平分别为65、57，尖断直径约0.5～1μm，充灌高钾电极液。电流经膜片钳放大器放大，探头反馈电阻10GΩ，低频滤波频率为1kHz（3dB，4-bessel），用PCM录像机记录。 4资料分析 信号经Digidata 1200接口的数据采集系统和6.04版Pclamp采集程序，采样频率5kHz，开关时间的忽略水平为200μs。将原始资料输入pⅢ-300计算机，用FETCHAN分析程序自动测量通道的电流幅度、通道开放和关闭时间，再进入pSTAT作初步统计处理。用SPSS8.0统计软件对各浓度组做线性 中日人民解放军第一军医大学硕士学位论文回归分析得出电导，分别以不同细胞、钳制电压或l和药物浓度为分组变量，分析定量变量，包括电流幅度、电导以及通道开关动力学的变化；各普鲁卡因浓度组间的电流幅度、电导以及通道开关动力学参数的差异行方差分析。 结果 1延迟鳖流型义沤沮的确认与特性 在一定的范围内，通道的电流幅度随去极化程度增加而增大，即随着钳制电压的变化而变化，所得的电流幅度－膜电位关系曲线O－V曲线）呈直线。各钳制电压与平均电流幅度的关系，反映电流幅度对电压的依赖关系。在某一钳制电压下，电流幅度．开放时间的散点图显示开放事件，均集中在一定的电流幅度水平，通过计算可以得出其优势电导为52土2．4ps，也表现出明显的电压依赖性。 采用内面向外式时，在本组实验液体下，通道的翻转电位（Rerersa Potential，EJ接近于 omV；以 140mmol的 cscl代替浴槽液中的KCI，通道电流基本消失；但用20 mm。l的个氨基毗唆（－AP）替代原浴液，通道电流活动则无变化。此外，TTX以及低钙整液中的 EGTA乙二醇双氨基乙基四乙酸）阻滞了钠、钙通t，氯离子通道难以记录到，因而确认其为延迟流型K＋1道。 二普鲁卡因对延追羹流型K31jt的影响 zl对迟邀电流幅匣与电导的影响 对照组与7个普鲁卡因浓度组各自的I－V曲线基本呈直线，此即为本实验记录单迟道；0．4mml组卜V关系线斜串最小，通道的电导达最低o6士1．4ps卜此后随浓度的增加电导逐渐增加， ～4～ 中国人民解放军第一军医大学硕土学位论文 并在Z4mmol时，电导值达最高O0士2刀昨入 2．ZRtrjljN开放动力学的彤响 对照组开放概率为引．6％士 3．9％，当浓度增加至 0．4mmol时， 开放概率骤降至26．2％士2．0％；尔后，随药物浓度的增加开放概 率逐渐提高，最高达78％土5．9％。在电压与开放概率的关系方面， 钳制电压O巾增加，开放概率逐渐减小，此时电极下的膜片跨膜 电位 vin＝－Vp，既当 Vp愈接近 VRE，vin就愈接近静息膜电位， 因而其开放概率就逐渐接近于零。 2．3对开放时间常数的彤响 对照组通道的短时程开放时间常数一。；）为75土6．329ms，当 浴槽液中加入 0．Zmmol的普鲁卡因，甚至更低浓度，＼；立即降 至 5土2．402ms，且此后＼；随药物浓度无明显的变化 长时程开放时间常数h。。）在加入药物后略有降低，当药物浓 度增至 0．4mmol时，。＊降至 24土 3．202ms，降幅约 15 土 1．4325， 药物浓度达 0．smmol时，＼。又达未加药时水平；继而在 1．6 nunol 时 T。达最高点，即 73士5．307ths；以后随药物浓度的增加＼2又 程下降态势；对开放时间的影响基本与长时程开放时间常数 T。。 相对应。 又4对关闭时间与关闭时间常数的影响 通道的关闭时间常数h。）对照组为78．566土16．9761：ifS，加入 药物后关闭时间延长，普鲁卡因浓度为0．4mmol时，关闭时间达 303．727 土78．3465，以后随浓度增加关闭时间逐渐变短，浓度 为 1．6