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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种原发性中枢神经系统退行性疾病,特征性的病理改变是患者脑内出现β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)为主要组成的老年斑、磷酸化tau蛋白为主要组成的神经原纤维缠结及神经元丢失,这些病理过程导致患者早期学习记忆能力减退,随后逐渐发展为智力障碍,晚期转变为严重痴呆。学习和记忆常用突触可塑性来表示,常用指标有长时程增强(long-term potentiation,LTP)和双脉冲易化(paired pulse facilitation,PPF)。AD患者脑内Aβ沉积能够抑制N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体依赖的细胞内级联反应、c AMP/PKA/CREB信号传导通路和PI3K/Akt信号传导通路来损伤LTP,进而损伤患者认知和记忆功能。AD和糖尿病在发病上具有联系:大部分的AD患者伴有糖尿病或空腹血糖升高,糖尿病也能增加AD的发病风险。研究发现:新型糖尿病治疗药物GLP-1(Glucagon-like peptide,GLP-1)受体激动剂—Exendin-4能够较好的控制血糖,并且能够调节患者的神经功能。但Exendin-4能否拮抗Aβ对突触传递的损伤及其作用的分子机制仍不清楚。因此,本课题研究目的是:(1)观察Aβ1-42寡聚体、Exendin-4对大鼠海马CA1区LTP和PPF的影响;(2)探讨Aβ1-42寡聚体、Exendin-4对海马CA1区NMDA受体、c AMP/PKA/CREB通路和PI3K/Akt信号通路的影响,研究Exendin-4对LTP的保护机制。第一部分Exendin-4保护大鼠在体海马LTP免受Aβ1-42损伤目的:从突触传递和可塑性角度探讨Exendin-4对Aβ1-42寡聚体神经毒性的拮抗作用。方法:应用脑立体定位仪将电极和给药管插入SD大鼠海马背侧,刺激海马schaffer侧支并记录海马CA1区放射层场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potentials,f EPSPs),观察Exendin-4,Aβ1-42寡聚体对海马CA1区LTP,PPF的影响。步骤:(1)单个脉冲剌激诱发和记录稳定的基础f EPSPs30分钟;(2)给药,再记录基础f EPSPs 30分钟;(3)记录三组PPF;(4)记录三组高频刺激(high frequency stimulation,HFS)诱发的LTP,恢复单脉冲剌激后记录f EPSPs 60分钟。结果:(1)对照组、Aβ1-42组、Exendin-4组、Exendin-4+Aβ1-42组等四组大鼠海马给药前后半小时不影响海马CA1区基础突触传递,给药前后各组基础f EPSPs平均幅度值约为100%±3%;(2)Aβ1-42寡聚体单独给药后显著抑制HFS诱导的LTP,0min和60min时f EPSPs幅度百分比分别为165%±2%和115%±3%,显著低于正常对照组(189%±5%和150%±6%,P<0.05);(3)Exendin-4可以显著拮抗Aβ1-42寡聚体对LTP的抑制作用,HFS后LTP高于Aβ1-42寡聚体单独给药组水平,0min和60min时f EPSPs幅度百分比分别为181%±4%和145%±3%,两组差异具有显著性(P<0.05);Exendin-4单独给药组基本不影响海马在体LTP诱导及维持。(4)实验各组的PPF均大于1,没有组间差异。结论:海马注射Aβ1-42寡聚体可以显著抑制在体CA1区LTP,预先给予Exendin-4可以有效拮抗Aβ1-42引起的大鼠在体海马LTP的抑制,说明在突触层面上,Exendin-4具有神经保护作用,可以使得突触传递和可塑性免受Aβ1-42寡聚体的损伤;海马给药对PPF无影响,说明Aβ1-42寡聚体对LTP的抑制主要是作用于突触后通路。第二部分Exendin-4保护在体海马LTP免受Aβ1-42损伤的分子机制目的:从Aβ1-42寡聚体抑制LTP信号通路角度探讨Exendin-4对大鼠海马CA1区LTP保护作用的主要机制。方法:将电生理实验后大鼠随机的分为两组:免疫组化组和ELISA组。免疫组化组大鼠打开胸腔露出心脏,用4%多聚甲醛心脏灌注,断头后取出脑组织,以10%中性甲醛固定;分别检测海马CA1区p-Ca MKIIα,p-CREB,p-Akt阳性表达情况。ELISA组大鼠断头处死,低温剥离海马组织,-80℃保存,用c AMP酶联免疫试剂盒检测单侧海马c AMP含量。结果:(1)检测海马CA1区磷酸化Ca MKIIα的免疫组织化学实验发现:海马注射Aβ1-42寡聚体能明显降低海马CA1区p-Ca MKIIα水平,同对照组相比差异显著(P<0.05);Exendin-4预处理能够拮抗Aβ1-42的去磷酸化作用,CA1区p-Ca MKIIα水平显著高于Aβ1-42单独给药组(P<0.05);Exendin-4单独给药对p-Ca MKIIα水平无明显影响。(2)应用ELISA实验和免疫组织化学实验检测单侧海马c AMP含量和海马CA1区磷酸化CREB发现:海马注射Aβ1-42寡聚体能明显降低海马c AMP含量和p-CREB水平,同对照组相比差异显著(P<0.05);Exendin-4预处理能够拮抗Aβ1-42的抑制作用,海马c AMP含量和p-CREB水平显著高于Aβ1-42单独给药组(P<0.05);Exendin-4单独给药对c AMP含量和p-CREB水平无明显影响。(3)海马CA1区磷酸化Akt的免疫组织化学实验检测发现:海马注射Aβ1-42寡聚体能明显降低海马CA1区p-Akt水平,同对照组相比差异显著(P<0.05);Exendin-4预处理能够拮抗Aβ1-42的去磷酸化作用,CA1区p-Akt水平显著的高于Aβ1-42组单独给药组(P<0.05);Exendin-4单独给药对p-Akt水平无明显影响。结论:海马注射Aβ1-42寡聚体可以显著降低CA1区Ca MKIIα磷酸化水平,说明Aβ1-42寡聚体可以抑制NMDA受体相关通路的蛋白活性来抑制LTP;海马注射Aβ1-42寡聚体可以显著降低c AMP含量和CREB磷酸化水平,说明Aβ1-42寡聚体可以抑制c AMP/PKA/CREB相关通路蛋白激活来抑制LTP;海马注射Aβ1-42寡聚体可以显著降低海马CA1区Akt磷酸化水平,说明Aβ1-42寡聚体可以抑制PI3K/Akt信号通路的蛋白活性来抑制LTP。预先海马注射Exendin-4后海马CA1区三种蛋白的磷酸化水平及海马c AMP含量并未明显降低,提示Exendin-4可能通过作用于NMDA受体、c AMP/PKA/CREB信号通和PI3K/Akt信号通路来发挥记忆保护作用。