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背景与目的多种因素可导致颌骨缺损,除颌裂、腭裂等先天性疾病之外,颌面外伤、囊肿、肿瘤等也常伴发骨吸收造成骨质缺损。颌骨缺损不仅影响面型和口腔功能,也对患者造成一定的心理影响,应用生物材料修复颌骨缺损是临床治疗的重要手段。生物材料介导的成骨过程主要包括三个相互作用的部分,即生物材料、免疫细胞和骨细胞。既往的研究更多的关注于生物材料对成骨细胞的直接调控,随着骨免疫学研究的深入,发现骨骼系统和免疫系统关系密切,免疫细胞尤其是巨噬细胞在骨骼重建以及生物材料与成骨细胞的相互作用中发挥着重要的作用。生物材料可通过调控巨噬细胞功能,改造骨免疫微环境进而影响成骨过程。因此,生物材料调控巨噬细胞,进而巨噬细胞介导生物材料成骨成为近年来组织工程与再生医学的的研究热点。仿生矿化胶原(Mineralized Collagen,MC)是一种与天然骨基质化学成分和微观结构高度一致的人工骨材料,大量研究证实矿化胶原可实现骨缺损的有效再生,但矿化胶原调控成骨的潜在机制尚不清楚。鉴于巨噬细胞在生物材料成骨中的关键作用,且课题组前期工作也证实矿化胶原的许多表观特征影响了巨噬细胞的功能及骨的修复过程,因此,明确巨噬细胞在矿化胶原促成骨中的作用以及矿化胶原调控巨噬细胞对成骨过程的影响有着重要的意义。本课题以免疫微环境影响生物材料成骨为背景,拟明确巨噬细胞在矿化胶原促骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化中的作用并阐明其机制,为基于巨噬细胞进一步优化矿化胶原或研发新型骨修复材料提供理论依据。材料与方法1.巨噬细胞增强矿化胶原促BMSCs成骨分化的作用(1)建立大鼠下颌骨缺损模型,将矿化胶原植入骨缺损区,通过X线、HE染色观察骨缺损的修复情况。(2)全骨髓贴壁培养法获取C57BL/6小鼠BMSCs,应用细胞克隆形成实验对细胞进行形成克隆能力的检测细胞,流式细胞术检测标志检测干细胞标记分子CD90、CD44、CD106和造血系标记分子CD34及白细胞标记分子CD45的表达,通过成骨、成脂及成软骨分化实验检测细胞的多项分化潜能。(3)成骨诱导培养基的制备:取巨噬细胞培养上清制备成骨诱导培养基,为Con组;根据国标(GB/T 16886.12-2005)制备矿化胶原和胶原浸提液,并进一步制备成骨诱导培养基,分别命名为MC和Col;将巨噬细胞分别接种于矿化胶原与胶原表面培养,取培养上清制备成骨诱导培养基,将矿化胶原与巨噬细胞和胶原与巨噬细胞来源的成骨诱导培养基分别命名为MCM和CCM。(4)用上述方法制备的不同来源的成骨诱导培养基对BMSCs进行成骨诱导,利用ALP染色和活性测定,茜素红染色和定量,qRT-PCR检测成骨相关基因的表达评价BMSCs成骨效果。2.矿化胶原调控的巨噬细胞分泌肾上腺髓质素(Adrenomedullin,ADM)促进BMSCs成骨分化(1)应用转录组测序技术筛选培养于矿化胶原和胶原表面的巨噬细胞内的差异表达基因,应用qRT-PCR验证测序结果,ELISA检测于矿化胶原表面培养的巨噬细胞培养上清中ADM的蛋白水平;组织免疫荧光观察ADM的表达与骨缺损修复的相关性。(2)细胞免疫荧光检测BMSCs表面ADM受体的表达;利用ALP染色和活性测定,茜素红染色和定量及qRT-PCR评价:外源性ADM对BMSCs成骨分化的影响,应用ADM抑制剂ADM22-52以及敲减巨噬细胞中ADM对MCM诱导的BMSCs成骨分化的影响。应用CCK-8及Transwell迁移实验检测ADM对BMSCs增殖及迁移的影响。3.矿化胶原调控的巨噬细胞分泌ADM激活PI3K/Akt通路促进BMSCs成骨分化(1)应用Western Blot检测MCM对BMSCs细胞中PI3K/Akt信号通路蛋白表达的影响;ALP染色和活性测定,茜素红染色和定量及qRT-PCR检测抑制PI3K/Akt通路对MCM诱导BMSCs成骨分化的影响。(2)应用Western Blot检测ADM对BMSCs内PI3K/Akt信号通路中关键蛋白表达的影响;应用ALP染色和活性测定,茜素红染色和定量及qRT-PCR检测抑制PI3K/Akt信号通路对ADM促BMSCs成骨分化的影响;应用CCK-8及Transwell迁移实验检测抑制PI3K/Akt信号通路对ADM促BMSCs增殖及迁移的影响。(3)建立下颌骨缺损模型,将ADM蛋白复合凝胶植入骨缺损区,通过X线,HE染色、Masson染色及免疫组化染色观察ADM对骨缺损的修复效果,并观察抑制PI3K/Akt通路后ADM的作用是否改变。结果1.巨噬细胞增强矿化胶原促BMSCs成骨分化的作用(1)X线及HE染色结果显示,矿化胶原和胶原的植入均有利于大鼠下颌骨缺损的修复,矿化胶原促下颌骨缺损修复的效果优于胶原。(2)全骨髓贴壁培养法获得了纯度高且具有克隆形成能力的BMSCs;流式细胞术检测到细胞表达间充质干细胞标志分子CD90、CD44和CD106,而不表达造血系标记分子CD34及白细胞标记分子CD45;所得细胞具有成骨、成脂及成软骨向分化能力。(3)ALP染色和活性测定,茜素红染色和定量及qRT-PCR检测表明,MC组较Col组BMSCs内ALP活性高、钙结节形成量多,成骨相关基因表达高;CCM组较Col组各项指标差异不显著;MCM组较Con、MC、CCM组BMSCs内ALP活性显著升高,钙结节量形成增多,成骨相关基因表达升高。2.矿化胶原调控的巨噬细胞分泌ADM促进BMSCs成骨分化(1)转录组测序结果显示矿化胶原诱导的巨噬细胞内高表达ADM,细胞内ADM的基因表达及细胞ADM蛋白的分泌水平在成骨早期均呈持续升高趋势;ADM在矿化胶原植入的骨缺损区高表达。(2)细胞免疫荧光结果显示BMSCs表达所有的ADM受体;外源性ADM可增强BMSCs内ALP活性,促进钙结节形成并上调成骨分化相关基因的表达;CCK-8及Transwell实验表明ADM可促进BMSCs的增殖和迁移。(3)ALP染色和活性测定,茜素红染色和定量及qRT-PCR结果表明应用ADM22-52抑制MCM中ADM的作用以及敲减巨噬细胞中ADM可使BMSCs的ALP活性降低,矿化结节形成减少,成骨分化基因表达降低。3.矿化胶原调控的巨噬细胞分泌ADM激活PI3K/Akt通路促进BMSCs成骨分化(1)Western Blot结果表明MCM和ADM均可上调PI3K/Akt通路关键蛋白的表达;ALP染色和活性测定,茜素红染色和定量及qRT-PCR结果表明抑制PI3K/Akt通路使MCM和ADM促BMSCs成骨作用受到了抑制;CCK-8及Transwell表明抑制PI3K/Akt通路使ADM促BMSCs增殖和迁移的作用受到抑制。(2)X线、HE染色、Masson染色和免疫组化染色结果显示,ADM可以促进下颌骨缺损的再生,阻断PI3K/Akt通路可抑制ADM的作用,证实ADM可通过激活PI3K/Akt信号通路促进成骨。结论本研究证实成骨微环境中矿化胶原可调控巨噬细胞表达和分泌ADM,矿化胶原调控的巨噬细胞分泌ADM通过激活BMSCs内PI3K/Akt信号通路促进其成骨分化。本研究为基于巨噬细胞/ADM加强矿化胶原的成骨诱导能力以及为新型仿生骨修复材料的研发提供了理论依据。