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第一部分PEDF对心肌梗死后大鼠心脏功能的影响目的:将慢病毒PEDF-LV或PEDF-RNAi-LV分别转染至大鼠心肌梗死边缘区,过表达或沉默表达PEDF,研究PEDF对心肌梗死后大鼠心脏功能的影响。方法:成年SD大鼠,结扎冠状动脉左前降支,建立心肌缺血动物模型。采用心肌内注射方法,沿心肌梗死区边缘分两点注射PEDF-LV或PEDF-RNAi-LV(病毒载体为本实验室前期制备);实验随机分为4组:正常组(未行开胸手术)、载体对照组(心梗模型建立后注射载体对照病毒)、PEDF过表达组(心梗模型建立后注射PEDF-LV病毒)和PEDF干扰表达组(心梗模型建立后注射PEDFRNAi-LV病毒);(大鼠共40只,每组10只)。模型建立4周后,应用超声心动图检测各组大鼠心脏功能,TTC(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色和MRI(Magnetic resonance imaging,核磁共振)检测大鼠心肌梗死面积。结果:成功建立大鼠心肌梗死模型。大鼠心肌梗死后,心肌梗死边缘区PEDF表达水平逐渐降低。慢病毒PEDF-LV或PEDF-RNAi-LV分别转染大鼠心肌梗死边缘区后,PEDF过表达组PEDF表达水平增加,PEDF干扰表达组PEDF表达水平下降,载体对照组无明显变化。模型建立4周时,与载体对照组相比,超声心动图结果显示PEDF干扰表达组LVEF(Left ventricular ejection fraction,左室射血分数)、LVFS(Left ventricular fractional shortening,左室短轴缩短率)显著降低,PEDF过表达组LVEF、LVFS显著升高;TTC染色和MRI检测结果显示PEDF干扰表达组心脏梗死面积显著增大,PEDF过表达组心脏梗死面积显著减小。结论:PEDF可减少缺血心脏梗死面积,改善梗死后心脏功能。第二部分PEDF-R介导PEDF保护缺血心肌细胞的作用和机制目的:分别在动物和细胞水平,研究PEDF通过PEDF-R对缺血缺氧心肌细胞的保护作用和相关机制。方法:动物模型构建和分组同第一部分。模型建立4周时,TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP nick end labeling,末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记测定法)荧光染色检测心肌梗死边缘区的心肌细胞凋亡,Western Blot检测凋亡相关蛋白表达。细胞水平,培养原代心肌细胞和H9c2细胞,建立细胞缺氧模型,随机分为正常组、缺氧对照组、PEDF处理组、PEDF+si PEDF-R组和PEDF+GW9662组(每组均n=5)。以1%O2低氧条件培养24h,在敲减表达PEDF-R时检测PLA2(Phospholipase A2,磷脂酶A2)活性和LPA(Lysophosphatidic acid,溶血磷脂酸)表达水平;在敲减表达PEDF-R或应用PPARγ(Peroxisome proliferator activated receptorγ,过氧化物酶体增殖物激活受体γ)阻断剂GW9662时观察细胞存活情况,并检测相关指标。TUNEL检测细胞凋亡率,Western blot法检测cleaved caspase-3蛋白表达,DCFH-DA(2’,7’-dichlorofluorescin diacetate,2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐)分子探针检测细胞内的ROS(Reactive oxygen species,活性氧),SOD(Superoxide dismutase,邻苯三酚自氧化法)检测超氧化物歧化酶,MDA(Methane dicarboxylic aldehyde,硫化巴比妥酸法)检测丙二醛。结果:大鼠心肌梗死模型建立4周时,与载体对照组相比,TUNEL荧光染色检测结果显示PEDF干扰表达组心肌细胞凋亡率显著增加,PEDF过表达组心肌细胞凋亡率显著降低;Western blot检测凋亡通路相关蛋白表达结果显示,PEDF干扰表达组cleaved caspase-8、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白表达量显著升高,PEDF过表达组则显著降低。在心肌细胞缺氧模型中,与缺氧对照组相比,PEDF处理组心肌细胞凋亡率显著降低;PEDF处理组氧化应激水平显著降低;PEDF处理组PLA2活性和LPA表达水平显著升高;PEDF处理组心肌细胞PPARγ表达水平显著上调。当敲减表达PEDF-R或应用PPARγ阻断剂GW9662后,PEDF的心肌细胞保护作用和抗氧化能力显著降低。敲减表达PEDF-R后,心肌细胞PPARγ表达水平显著下调。结论:PEDF可减少缺血缺氧下的心肌细胞凋亡;PEDF可通过激活PEDF-R的PLA2活性,上调PPARγ,增强抗氧化能力而保护缺氧心肌细胞。第三部分PEDF-R介导PEDF抗缺血心脏血管渗漏的作用和机制目的:分别在动物和细胞水平,研究PEDF通过PEDF-R抗缺血心脏血管渗漏的作用和相关机制。方法:动物模型构建和分组同第一部分。模型建立4周时,Evans Blue法检测心脏梗死边缘区血管渗漏程度;Western blot和免疫共沉淀检测内皮细胞间连接的主要标志VE-cadherin(Vascular endothelial-cadherin,血管内皮钙粘蛋白)、β-catenin(β-链蛋白)和Occludin(紧密连接蛋白),观察PEDF对大鼠缺血心肌血管渗透性的影响。细胞水平,培养RAECs(rat aortic endothelial cells,大鼠主动脉内皮细胞),建立细胞缺氧模型,随机分为正常组、缺氧对照组、PEDF处理组、PEDF+si PEDF-R组和PEDF+GW9662组(每组均n=5)。以1%O2低氧条件培养24h,检测细胞的渗漏情况,并检测内皮细胞间连接的主要标志粘附连接蛋白VE-cadherin/β-catenin复合体、紧密连接蛋白Occludin和ZO-1;免疫荧光检测细胞紧密连接ZO-1,观察PEDF对缺氧RAECs的影响。结果:大鼠心肌梗死模型建立4周时,与载体对照组相比,Evans blue心脏血管灌注结果显示PEDF过表达组心脏基本无蓝染,PEDF干扰表达组心脏梗死局部蓝染显著;心肌组织匀浆Evans blue含量检测显示,PEDF干扰表达组心肌组织匀浆Evans blue含量显著升高,PEDF过表达组则显著降低;Western blot检测结果显示,PEDF干扰表达组Occludin蛋白表达水平显著下降,而PEDF过表达组则显著增多;PEDF干扰表达组VE-cadherin磷酸化水平显著增高,而PEDF过表达组显著降低;免疫共沉淀结果也显示,PEDF干扰表达组VE-cadherin/β-catenin复合体减少,而PEDF过表达组VE-cadherin/β-catenin复合体增多。在主动脉内皮细胞缺氧模型中,与缺氧对照组相比,PEDF处理组细胞渗漏程度显著降低;PEDF处理组内皮细胞连接稳定;PEDF处理组内皮细胞紧密连接蛋白Occludin、ZO-1表达水平上调,内皮细胞粘附连接VE-cadherin/β-catenin复合体增多;PEDF处理组心肌细胞PPARγ表达水平显著上调。当敲减表达PEDF-R或应用PPARγ阻断剂GW9662后,PEDF的抗渗漏作用显著降低,内皮细胞紧密连接蛋白Occludin、ZO-1表达水平下调,但内皮细胞粘附连接VE-cadherin/β-catenin复合体结合不受影响。敲减表达PEDF-R后,内皮细胞PPARγ表达水平显著下调。结论:PEDF可抑制缺血心脏血管渗漏;PEDF可维持缺氧内皮细胞连接稳定;PEDF维持内皮细胞紧密连接的稳定通过PEDF-R上调PPARγ实现,但内皮细胞粘附连接的稳定与PEDF-R/PPARγ通路无关。