【摘 要】
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锌是人体必需的微量元素,锌的缺乏会导致人体生长发育缓慢,身体免疫功能失调。天然蛋白源肽锌螯合物作为一种新兴的锌补充剂,因其具有营养丰富,安全性高,易吸收的特性而具有巨大的开发潜力。然而肽锌螯合物的螯合机理不清等问题限制了其应用。大豆是一种优质的蛋白资源,是制备生物活性肽的良好天然蛋白源。本文通过酶解大豆分离蛋白制备肽锌螯合物,获得最佳制备工艺;然后分析其理化性质和结构特征;进一步对大豆锌螯合肽进行
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锌是人体必需的微量元素,锌的缺乏会导致人体生长发育缓慢,身体免疫功能失调。天然蛋白源肽锌螯合物作为一种新兴的锌补充剂,因其具有营养丰富,安全性高,易吸收的特性而具有巨大的开发潜力。然而肽锌螯合物的螯合机理不清等问题限制了其应用。大豆是一种优质的蛋白资源,是制备生物活性肽的良好天然蛋白源。本文通过酶解大豆分离蛋白制备肽锌螯合物,获得最佳制备工艺;然后分析其理化性质和结构特征;进一步对大豆锌螯合肽进行分离纯化,借助质谱鉴定和分子动力学模拟从分子水平阐明其螯合机理;最后,采用体外模拟胃肠道消化模型评估大豆肽锌螯合物的生物利用率,并探讨了其抗氧化和抗菌生物活性。首先,比较5种蛋白酶对大豆分离蛋白酶解产物锌螯合率的影响,结果表明经胰蛋白酶水解后大豆肽的锌螯合率最高。以锌螯合率为指标,结合单因素和正交试验,获得酶解制备大豆肽的最优条件为:酶解温度45℃、酶解p H值8.0、胰蛋白酶加酶量6%、底物质量分数5%、酶解时间4 h,此条件下大豆肽的锌螯合率为59.37%;螯合反应的最优条件为:肽锌质量比4:1、温度60℃、p H 5.0、时间60 min,该条件下的锌螯合率可达82.22%。与锌配合后,大豆肽锌螯合物表面呈均匀疏松的微观结构,氨基酸组成中谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸含量增加,分别提高26.56%、14.75%、11.66%和4.38%,傅里叶变换红外光谱和固体核磁共振结果表明肽链中的-NH-、-OH、-C=O和-COOH可能参与螯合反应。然后,采用超滤、凝胶过滤层析和阴离子交换层析技术对大豆肽进行分级分离,得到锌螯合率高的组分F323。利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术,从F323中鉴定筛选出六条潜在的新型大豆锌螯合肽,其中有四条和两条肽分别来自于大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。通过验证合成肽的锌螯合率,获得三条锌螯合能力最高的多肽VFDGELQEGR、EEGQQQGEQR和EEQEWPR,锌螯合率分别为93.75%,90.19%和83.22%。分子动力学模拟结果表明,VFDGELQEGR中Asp3、Glu5和Glu8氨基酸侧链中的羧基O原子和两个水分子与Zn2+配位促进肽锌结合;EEGQQQGEQR中的Glu2、Gln6和Glu8氨基酸侧链中的O原子与Zn2+螯合,形成3个配位键;EEQEWPR中氨基酸Glu1、Glu2、Glu4和一个水分子与Zn2+配位促进肽锌结合,形成稳定的大豆肽锌螯合物分子结构。最后,体外模拟胃肠道消化结果发现,大豆肽锌螯合物在胃和肠道的溶解率分别为92.85%和54.34%,肠道透过率最高为51.02%,均高于无机锌盐。这表明在胃肠道条件下,大豆肽锌螯合物具有优于无机锌盐的保留和吸收特性,并可能增加锌的生物利用度。大豆肽锌螯合物具有抗氧化活性,但其对DPPH自由基、羟基自由基的清除能力和Fe3+还原能力均低于大豆肽。抗菌实验结果表明,大豆肽锌螯合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和单增李斯特菌均有抑制作用,对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度为62.5 mg/m L;扫描电镜和透射电镜结果表明大豆肽锌螯合物能够改变细胞形态,使细胞壁和细胞膜结构破损,造成细胞内物质的泄漏。
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