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体外受精-胚胎移植（In vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET）是辅助生殖技术（Assisted reproductive technology,ART）的主要手段之一,为不孕症患者的治疗做出极大贡献。尽管通过IVF助孕分娩的绝大多数子代都是健康的,但也有一些令人担忧的研究结果,如:妊娠期高血压疾病、前置胎盘、早产和低出生体重等胎盘源性疾病的发病率有所增加。因此,如何提高IVF母体及子代的安全性成为亟待解决的问题。胎盘对胎儿的宫内发育和生长起着至关重要的作用,且在胎儿发育过程中参与多种功能,如营养物质、废物和气体的交换,母体免疫防御以及激素和细胞因子的合成等。胎盘血管是母儿之间营养物质以及代谢产物交换的通道。胎盘血管发育异常会影响胚胎和胎儿的发育,进而增加围产期不良结局的风险。胎盘发育贯穿整个妊娠期,表观遗传修饰可通过调节基因的转录以及翻译,影响胎盘的功能和特性。研究发现IVF助孕可以引起表观遗传改变,比如DNA甲基化修饰错误、重编程时期基因印记缺失、miRNA的异常表达等。既往研究表明IVF促排中超生理剂量的雌激素、卵子和精子的获取及保存、体外培养、胚胎移植和显微操作等,有别于正常的自然妊娠过程。这些改变都有可能通过表观遗传修饰对配子发生、胎儿发育以及妊娠环境造成影响。尽管许多研究表明这些变化可能与胎盘发育相关,但潜在的分子机制尚不明确。目的本研究通过对自然妊娠与IVF助孕来源的胎盘组织进行甲基化DNA免疫共沉淀测序（Me DIP-seq）、miRNA测序（miRNA-seq）和mRNA测序（mRNA-seq）,检测DNA甲基化、miRNA和mRNA的差异表达情况,探讨IVF助孕影响胎盘发育的潜在分子机制,为进一步提高IVF在临床应用中的安全性提供新的依据。材料与方法1研究对象与分组本研究选取自然妊娠和IVF妊娠来源的胎盘组织共22例。IVF组纳入标准:年龄＜35岁;仅因输卵管因素行IVF助孕后单胎妊娠;孕足月行剖宫产分娩;无妊娠并发症。对照组纳入与之严格匹配的自然妊娠产妇,以产妇年龄、产次、孕周以及胎儿性别等作为匹配参数。本研究经过郑州大学第三附属医院伦理委员会批准【2021-016-01】,并获得了标本提供者的知情同意。2方法2.1对3例IVF组样本和3例对照组样本进行mRNA测序,使用R语言中的DESeq2包筛选出差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）（差异倍数＞1.5,P＜0.05）。结合DAVID数据库,利用R Studio中的clusterprofilter包对DEGs进行基因本体论（Gene Ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析。通过STRING在线工具及Cytoscape构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络,并获取关键基因进行生物学分析。2.2使用上述两组样本进行miRNA测序,结合R语言中的DESeq2包,以差异倍数＞1.5、P＜0.05为筛选标准,筛选差异表达的miRNA（Differentially expressed miRNAs,DEmiRs）。利用Fun Rich软件预测DEmiRs的转录因子并进行富集分析。应用miRWalk V2.0、Star Base和Target Scan数据库来预测DEmiRs的靶基因。2.3对上述两组样本进行甲基化DNA免疫共沉淀测序,利用R语言中的MEDIPS包将差异甲基化区域（Differential methylation regions,DMRs）和基因进行关联（差异倍数＞2、P＜0.05）,筛选出IVF组胎盘组织中的差异甲基化基因（Differential methylation genes,DMGs）,并对其进行GO与KEGG富集分析。2.4将Me DIP-seq和mRNA-seq筛选出的差异显著基因进行联合分析,筛选出在IVF胎盘组织中低甲基化且高表达的基因。选取8例IVF组样本和8例对照组样本,通过qRT-PCR验证差异基因的mRNA表达水平,焦磷酸测序验证差异甲基化基因CpG位点的甲基化水平。2.5对miRNA-seq和mRNA-seq数据进行整合分析,利用Cytoscape构建miRNA-mRNA表达网络,并选取8例IVF组样本和8例对照组样本,通过qRT-PCR对DEmiRs进行验证。3统计学分析本研究中的数据采用SPSS 20.0和Graph Pad Prism 8.0进行统计学分析,定量资料根据是否符合正态分布使用均数±标准差（Mean±SD）或中位数（四分位数间距）表示,采用Student’s-t检验或Mann-Whitney U检验分析两组数据之间的差异。当P＜0.05时,认为差异有统计学意义。结果1.mRNA-seq共鉴定出258个差异表达基因（差异倍数＞1.5,P＜0.05）,其中IVF组有52个下调的基因和206个上调的基因。差异表达基因GO和KEGG富集结果显示:血管生成、妊娠、血管生成正调控和细胞黏附等生物学过程富集最显著;PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路以及黏着斑通路显著富集。EGFR是PPI网络10个关键基因中连接度最高的基因。2.miRNA-seq鉴定出12个差异表达的miRNA（差异倍数＞1.5,P＜0.05）。其中IVF组有8个表达上调的miRNA,4个表达下调的miRNA。筛选出与DEmiRs密切关联的10个转录因子,且SP1能够调节大部分DEmiRs。qRT-PCR证实IVF组miR-204-5p、miR-1269a和miR-941表达下调,而miR-4286、miR-31-5p和miR-125b-5p表达上调（P＜0.05;P＜0.01）。3.Me DIP-seq筛选出两组胎盘组织中共有2551个差异甲基化基因（差异倍数＞2.0,P＜0.05）,其中高甲基化基因2446个,低甲基化基因105个。差异甲基化基因主要参与端脑发育、胚胎肢体形态和大脑皮层发育等生物学过程,以及Rap1信号通路、Hippo信号通路、ECM-受体相互作用和黏着斑等信号通路。4.对Me DIP-seq和mRNA-seq中筛选出的差异显著基因进行整合分析,结果显示TFPI、NDRG1、ERRFI1、NSRP1、POR、TACC2和LEP低甲基化且高表达。5.miRNA-mRNA调控网络共有10个miRNAs和109个mRNAs,其中下调的miR-204-5p、miR-1269a和miR-941含有更广泛的靶基因,而上调的miRNAs靶基因较少。结论1.与自然妊娠相比,IVF妊娠胎盘组织中的DNA甲基化谱、miRNA表达谱和mRNA表达谱发生改变。2.IVF助孕可能通过降低TFPI、NDRG1、ERRFI1、NSRP1、POR、TACC2和LEP启动子区域DNA甲基化修饰水平、增加mRNA表达,参与调控胎盘发育。3.IVF助孕可能通过影响胎盘组织中miR-204-5p、miR-1269a、miR-941、miR-4286、miR-31-5p和miR-125b-5p的表达水平参与调控胎盘发育。