【摘 要】
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菱角（Trapa bispinosaL.）是一年生水生草本植物,在我国长江三角和珠江三角流域等地均有广泛种植,资源极其丰富。菱角作为我国历史悠久的药食同源植物,其资源化开发甚少。多糖是菱角中的主要活性成分之一,其结构、活性、机制及其构效关系等一系列基础研究相当匮乏,严重桎梏其资源化开发与利用。基于此,本文以菱角为实验材料,利用超声辅助提取联合柱层析技术制备菱角多糖,并对其结构、溶液链构象、免疫活性
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菱角（Trapa bispinosaL.）是一年生水生草本植物,在我国长江三角和珠江三角流域等地均有广泛种植,资源极其丰富。菱角作为我国历史悠久的药食同源植物,其资源化开发甚少。多糖是菱角中的主要活性成分之一,其结构、活性、机制及其构效关系等一系列基础研究相当匮乏,严重桎梏其资源化开发与利用。基于此,本文以菱角为实验材料,利用超声辅助提取联合柱层析技术制备菱角多糖,并对其结构、溶液链构象、免疫活性及其机制进行研究。期望为菱角多糖开发及功能活性发掘奠定新的理论基础和依据,同时也为菱角的精深加工及增值化研究提供思路和可借鉴的方法。论文的主要研究内容和结果如下:（1）菱角多糖的超声辅助提取及活性初探以菱角多糖提取率为考察指标,通过单因素实验和响应面设计优化菱角多糖的超声辅助提取工艺,确定了最佳提取技术参数为:提取温度95℃,提取时间17 min,超声功率150 W,液料比50 mL/g,在此条件下,菱角多糖的得率为39.74%,较传统热水浸提法提取率提高了245.26%,提取时间缩短了90.55%。通过离子交换柱色谱分离纯化得到菱角中性多糖TBP-W和菱角酸性多糖TBP-S,经红外光谱、刚果红实验和综合热分析确定TBP-W和TBP-S均为吡喃糖,其中TBP-S中仍含有蛋白质,两者在溶液中均未呈现三螺旋构象,且在食品常用热处理温度下均具有良好的热稳定性;在实验浓度范围内（25-400 μg/mL）,TBP-W和TBP-S均能显著刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的增殖（p＜0.05）,其中TBP-W展示出更好的免疫促增殖特性,因此,选择TBP-W作为下一步研究的样品。（2）菱角多糖的分离纯化及结构表征TBP-W经葡聚糖凝胶柱分离,得到多糖组分TBP-W1,纯度为98.7%,不含蛋白质、核酸、色素等杂质。经化学方法结合色谱、质谱、光谱、波谱及显微成像等技术对TBP-W1进行结构表征。结果表明,TBP-W1是一种分子量为5.055 kDa的均一性杂多糖,主要由葡萄糖（94.05%）、阿拉伯糖（3.62%）、甘露糖（1.45%）和木糖（0.88%）组成。主链主要由→6)-β-D-Glcp-（1→和→4,6）-β(→构成,支链由 α-D-Glcp-（1→、→4）-α-D-Glcp-（1→、→2,6）-β-D-Glcp-（1→和→3）-α-D-Glcp-(1→构成,其分支点推测为主链上 β-D-Glcp 的 O-4位点。该多糖在溶液中具有三股螺旋构象,微米级表面形貌为带有少量气孔、沟壑,稍显卷曲的光滑片状和杆状形貌,纳米级分子形貌为直径在89-403 nm、高度在0.670-9.853 nm的圆锥形颗粒状聚集体。（3）菱角多糖对巨噬细胞免疫激活效应及机制研究基于小鼠RAW264.7单核巨噬细胞模型,通过测定TBP-W1对巨噬细胞增殖、吞噬能力、释放NO分子和分泌肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）的影响,研究TBP-W1的免疫激活特性,并揭示其免疫激活位点和效应途径。结果表明,在实验浓度范围内（25-200μg/mL）,TBP-W1能显著促进RAW264.7细胞增殖分化、增强其吞噬能力、促进NO分子的释放和炎症因子TNF-α和IL-6的分泌（p＜0.05）,且在一定程度上呈现剂量-效应依赖关系,说明TBP-W1具有显著的免疫激活特性。此外,Toll样受体（TLR4和TLR2）和清道夫受体（SR）是TBP-W1在RAW264.7细胞膜上的主要模式识别受体。综上所述,均一分子量菱角多糖TBP-W1能激活RAW264.7细胞表面TLR4、TLR2和SR受体,并通过三种受体共同协作诱导的信号通路来活化RAW264.7细胞,进而实现免疫激活效应。
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