恐惧、焦虑以及创伤性相关疾病都是由于外在特殊的事物、场景、内在或者外在的特定危险性线索或者实际存在危险所产生的过度应激反应,是一种机体面对危险环境时做出的适应性防御反应。病理性的恐惧和焦虑发生在各种特征的精神类疾病中,包括社交恐惧症(social anxiety disorder),广场恐怖症(agoraphobia)或者特殊类型的物体恐怖(specific phobia),惊恐障碍(panic disorder),强迫症(obsessive–compulsive disorder),广泛性焦虑(generalized anxiety disorder)以及创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder,PTSD)等恐惧相关疾。流行病学显示,这些以精神紊乱为特征的精神类疾病未来在人群中的终生发病率估计会增加到28%。目前,PTSD的患病率在心理疾病中已排到第四位。超过90%的普通人群在一生中会遭受至少一次严重的创伤事件,而一次严重的创伤事件就有可能诱发PTSD。由焦虑引起的精神疾病不仅给个人造成痛苦,更增加了额外的经济负担。因此,开发研究用于治疗精神类疾病的药物尤为紧迫。有研究显示,通过激活γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)可以抑制脑内相关介导恐惧的神经环路。通过药理学以及基因鼠模型研究发现,γ氨基丁酸有重要的生理作用,GABA系统也同样是苯二氮卓类药物作用的常用药物的作用靶点。例如,全身性给予苯二氮卓类药物激活这类受体可以减轻焦虑,而直接给药到杏仁核内同样能缓解动物的焦虑状态。(+)-二莰醇,是从菊科艾纳香茎叶或樟科植物龙脑樟枝中提取的一种双环单萜类中药,被广泛应用于食物以及传统医疗行业。最近研究显示,(+)-二莰醇具有多种药理学效应,包括神经保护,镇痛,抗抑郁,抗炎症以及抗惊厥等作用。此外,药理学研究表明(+)-二莰醇可以增强表达在模式细胞(非洲爪蟾卵母细胞)上的GABA受体介导的GABA电流,而给予GABA受体的阻断剂荷包牡丹碱或者苯二氮卓受体阻断剂氟马泽尼可以拮抗镇痛和抗惊厥作用,说明该药物在GABA系统中发挥着正向调节作用,从而发挥相应的药效。由于作用于GABA系统的药物在精神类疾病中发挥着重要作用,而(+)-二莰醇对GABA类药物有正向调节,因此我们探究(+)-二莰醇在恐惧以及焦虑相关疾病中是否有作用呢?由于海马是学习记忆以及情绪调控参与的关键脑区,而根据其解剖学特点,又分为背侧海马和腹侧海马两区。众所周知,背侧海马主要介导学习相关功能,如恐惧记忆、空间学习等,而腹侧海马主要参与情绪反应,如应激、焦虑等等。因此,我们具体研究了(+)-二莰醇注射在海马不同脑区在恐惧记忆学习以及焦虑中所发挥的作用。我们猜测,背腹侧海马给予(+)-二莰醇可能在恐惧和焦虑中发挥着不同的药理作用,因此本课题设计了三部分实验内容:(1)探究在背腹侧海马内给药在背景以及条件关联型恐惧记忆中提取中的作用;(2)研究(+)-二莰醇背腹侧海马内给药在焦虑中的作用;(3)探讨背腹侧海马内给药在恐惧记忆学习和焦虑中产生不同药理作用的相关机制。第一部分首先为了确定(+)-二莰醇在恐惧记忆提取中是否发挥作用,我们采用了背景关联型恐惧记忆学习模型。第一天进行电击造模后,于24小时或者7天后进行恐惧记忆的提取,在恐惧记忆提取前30分钟给予(+)-二莰醇。结果发现,全身给药产生作用,抑制24小时以及7天后的恐惧记忆表达。为了进一步确定发挥药效的脑区,我们分别在背侧以及腹侧海马给予药物,结果显示在背侧海马内注射药物有抑制恐惧表达作用,而在腹侧海马内给药并不影响恐惧记忆的表达。说明在背景关联的恐惧记忆模型下,背侧海马主要参与该类型恐惧记忆提取并且药物在该脑区发挥作用。为了研究在条件关联的恐惧记忆学习中,(+)-二莰醇是否同样发挥作用,我们采用了声音关联型恐惧记忆模型,同样第一天造模,24小时或者7天后进行测试,记忆提取前30分钟给予药物。结果发现,全身给药抑制24小时声音关联型恐惧记忆表达而不影响7天的表达。背腹侧海马内给药结果显示,腹侧而非背侧海马内给予(+)-二莰醇抑制24小时后声音关联型恐惧记忆表达。与全身给药结果一致的是,该抑制恐惧作用也仅体现在24小时恐惧记忆的提取,而在7天后声音关联型恐惧的提取中没有作用。第二部分为了研究(+)-二莰醇在焦虑中的作用,我们采用了焦虑行为的经典评价模型,分别是旷场实验,明暗箱实验以及高架十字迷宫实验。研究结果表明,在旷场实验中,背侧海马给予(+)-二莰醇增加了在旷场中心区的次数以及距离,而对于小鼠总的活动度没有影响。腹侧海马内给药并没有产生类似药理学效应。在明暗箱实验中,背侧海马给予药物增加了在明箱中的累计时间,而腹侧海马内给药并没有产生类似效应。在高架十字迷宫实验中,背侧海马内给予(+)-二莰醇增加了小鼠在开臂的时间以及次数,而总的活动次数并没有增加,表明在背侧海马给予药物产生了抗焦虑作用,而腹侧海马内给予(+)-二莰醇并没有产生类似效应。以上结果均表明,背侧海马而非腹侧海马内给予(+)-二莰醇有抗焦虑样作用。第三部分为了研究(+)-二莰醇在背腹侧海马发挥抑制恐惧记忆提取以及抗焦虑的作用机制,我们进行了行为学,电生理以及生化实验研究。首先,在24小时后的背景关联型恐惧记忆提取中,我们在测试前60分钟给予GABA受体阻断剂荷包牡丹碱,30分钟后给予(+)-二莰醇,结果显示(+)-二莰醇的抑制恐惧记忆提取作用消失,表明(+)-二莰醇抑制恐惧记忆表达是通过GABA系统发挥作用。在电生理实验中,我们在脑片上全细胞记录了海马内锥体神经元的GABA电流,结果显示,(+)-二莰醇可以增强GABA电流的释放。由于在背侧而非腹侧海马内给予(+)-二莰醇产生抗焦虑样作用,而(+)-二莰醇通过促进GABA功能发挥作用,是否这两个脑区的GABA受体分布不同,从而导致了在海马背侧的药效要比腹侧海马强呢?免疫组化以及蛋白免疫印迹结果显示,背侧海马总的GABA受体表达多于腹侧,其中α1亚基有明显差异,α2以及α5均无明显差异。而α1主要介导了突触后GABA的快速抑制作用,所以该结果解释了背侧海马的抑制性强于腹侧海马,因此背侧海马给药抑制了24小时以及7天后的背景关联恐惧记忆提取,而腹侧海马给药仅仅抑制24小时声音关联型恐惧记忆提取,同时背侧而非腹侧海马给药产生了抗焦虑样作用。综上所述,在恐惧记忆提取中,背侧海马内给予(+)-二莰醇抑制背景关联型恐惧记忆提取,而腹侧海马内给予(+)-二莰醇抑制条件关联型恐惧记忆提取。在焦虑行为中,背侧海马而非腹侧海马内给予(+)-二莰醇有抗焦虑样作用。该药理效应的实现依赖于(+)-二莰醇对于GABA系统的正向调节作用以及背腹侧海马内GABA受体分布的差异。