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自交不亲和性是开花植物抑制自交、促进异交的自然现象,是杂种优势利用的重要途径。已有研究表明,花粉端SP11/SCR(S-locus protein 11 or S-locus Cys-rich protein)与柱头端SRK(S-locus receptor kinase)相互识别及SRK下游信号传导导致甘蓝型油菜自交不亲和性。本文研究芸薹属BnSCR1-BnSRK1-BnARC1自交不亲和信号通路在拟南芥中的保守性,自交不亲和系“W-3”的BnSCR1基因和BnSRK1基因启动子顺式作用元件及反式调控因子,为进一步揭示甘蓝型油菜自交不亲和机理、芸薹属自交不亲和信号路径奠定基础。主要结果如下。1.构建pORE_O4-BnSCR1+BnSRK1和pORE_O4-BnSCR1+BnSRK1+BnARC1两种过表达载体,分别导入Col-0和C24两种生态型拟南芥,获得Col-0和C24过表达BnSCR1+BnSRK1转基因植株21株和13株,Col-0和C24过表达BnSCR1+BnSRK1+BnARC1转基因植株12株和9株。通过授粉试验观察、角果长度和每角果粒数考察及外源基因表达检测,发现所有转基因植株自交亲和,说明在拟南芥Col-0和C24中,芸薹属自交不亲和信号通路BnSCR1-BnSRK1-BnARC1不起作用。2.克隆了BnSRK1基因2 kb启动子序列;启动子分析表明,PR1-GUS(-1809~-1 bp)和PR2-GUS(-1314~-1 bp)能够驱动GUS基因在柱头中表达;启动子缺失分析结果表明,调控BnSRK1基因表达的关键调控区域位于-1314~-1000 bp。克隆了Ⅱ类S单倍型的Bn SCR-1300基因翻译起始位点上游504 bp启动子和Bn SCR-6基因翻译起始位点上游416 bp启动子,启动子分析表明60P-GUS(-504~-1 bp)和15P-GUS(-416~-1 bp)均能驱动GUS基因在转基因拟南芥花药发育的第9期至11期的绒毡层表达。3.通过酵母单杂交实验获得了与BnSCR1基因684 bp启动子结合的转录因子BnPHL2α。两轮诱饵序列截短实验表明BnPHL2α与p16X-3-Ab Ai的16 bp(TTTAATTTCTTGCATA)序列互作。亚细胞定位结果表明BnPHL2α定位在细胞核中。利用AH109酵母菌株没有检测到BnPHL2α的转录活性;通过BnPHL2α转录激活/抑制结构分析,发现BnPHL2α存在两个保守区域(位于136-185 aa的MYB CC结构域、37-90 aa的MYB DNA结合结构域)可能是该蛋白的抑制区域。双荧光素酶报告(Dual luciferase reporter,DLR)系统检测BnPHL2α基因对BnSCR1启动子P342活性表明,BnPHL2α基因抑制P342启动子的活性;P342启动子区域(-310至-295 bp)序列(TTTAATTTCTTGCATA)的一系列突变实验表明,BnPHL2α对BnSCR1启动子P342活性调控的抑制位点位于-310至-295 bp区域。EMSA实验验证,BnPHL2α蛋白能够与“TTTAATTTCTTGCATA”序列互作。利用CRISPR技术敲除“Westar”中BnPHL2α基因,获得了4株T0代阳性苗,测序分析阳性苗均为嵌合体突变的植株。