研究背景天然免疫是人体等宿主对抗入侵病原微生物的第一道屏障。cGAS-cGAMP-STING介导的信号通路是宿主天然免疫系统的重要组成成分。cGAS（cyclic GMP-AMP Synthase）是哺乳动物细胞中的一种双链DNA感受器,当细胞被病原微生物感染时,cGAS识别入侵哺乳动物细胞的病原微生物携带的双链DNA（double-stranded DNA,dsDNA）后激活,催化宿主细胞内的 ATP 和 GTP 合成 2’3’-cGAMP（2’3’-cyclic GMP-AMP）,后者结合 STING（Stimulator ofInterferon Genes,STING）后激活STING,活化的STING募集TANK结合激酶1（TBK1）,促进下游转录因子IFN调节因子3（IRF3）磷酸化入核,提高I型干扰素的表达并引发天然免疫反应。2’3’-cGAMP是环二核苷酸（Cyclic Dinucleotides,CDNs）家族成员之一。环二核苷酸作为新发现的第二信使分子调控细胞的多种生物学功能,也在哺乳动物细胞中参与天然免疫反应。另外,cGAS-cGAMP-STING信号通路不仅介导人体对DNA病毒的宿主防御,也是细菌抵御噬菌体感染的重要途径。cGAS-cGAMP-STING信号作为宿主对多种DNA病毒免疫防御的重要机制,其信号异常也将导致免疫逃逸。如病原微生物通过降解cGAS阻断胞质dsDNA的感应,或者通过降解2’3’-cGAMP导致STING无法被激活而实现免疫逃逸。KSHV（Kaposi’s Sarcoma-associated Herpesvirus,KSHV）是一种重要的人类肿瘤病毒,是产生卡波西肉瘤、原发性渗出性淋巴瘤等疾病的病原体。新近发现KSHV病毒的开放读码框52（orf52）基因编码的间质蛋白ORF52（又名KicGAS）可特异性地抑制cGAS的活性,导致机体的免疫逃逸。但ORF52抑制cGAS的结构基础及机制尚不完全清楚。细菌中存在的功能性的cGAS-cGAMP-STING信号是近年来的新发现,并在细菌抵御噬菌体感染过程中发挥重要作用。如霍乱弧菌Vibrio cholerae被噬菌体感染后,宿主会以某种方式触发DncV（Dinucleotide cyclase in Vibrio）合成3’3’-cGAMP分子。DncV与cGAS同属cGAS/DncV样核苷酸转移酶超家族（cGAS/DncV-like Nucleotidyltransferases,CD-NTases）。3’3’-cGAMP 通过激活磷脂酶CapV（cGAMP-activated phospholipase in Vibrio）而水解膜磷脂,导致被噬菌体感染的霍乱弧菌细胞膜破裂死亡,从而阻止噬菌体的扩散。已发现这种抗噬菌体的防御系统存在于10%以上的已测序的细菌基因组中,说明cGAS-cGAMP-STING通路具有古老的进化根源。因此,通过研究病毒、细菌等病原微生物调控或应答cGAS-cGAMP信号的相关蛋白,将为理解病原微生物对人体cGAS-cGAMP-STING介导的天然免疫的影响、以及药靶/药物的研发提供重要的理论依据。本论文根据前沿研究,选取KSHV病毒蛋白ORF52、霍乱弧菌蛋白CapV,通过解析其蛋白结构、分析其功能及作用机制,阐明它们对cGAS-cGAMP-STING信号的调控及应答的分子结构基础:（1）KSHV病毒通过ORF52抑制cGAS活性,但ORF52抑制cGAS活性的分子机制尚不清楚;（2）CapV为环二核苷酸3’3’-cGAMP依赖性磷脂酶,通过结合3’3’-cGAMP后被激活而发挥水解膜磷脂的作用。但CapV与已知的cGAMP结合蛋白没有结构同源性,CapV如何结合3’3’-cGAMP分子并被其激活的结构基础及机制尚不清楚。本论文围绕上述问题进行探讨,以期深入了解ORF52和CapV在介导宿主天然免疫中的结构基础及分子机制。研究内容一、cGAS-cGAMP组分的制备与纯化为了从蛋白结构角度研究ORF52、CapV介导cGAS-cGAMP-STING信号相关的结构机制,首先制备纯化不同种属的cGAS蛋白,包括人源cGAS（hcGAS,下文简称hcGAS）和鼠源cGAS（mcGAS,下文简称mcGAS）。并且利用微生物发酵制备合成环二核苷酸,包括c-di-GMP,3’3’-cGAMP以及2’3’-cGAMP。1、cGAS蛋白的制备与纯化利用大肠杆菌系统表达cGAS蛋白,所用的表达载体和菌株分别为His-SUMO、E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIL,经过三步纯化获得表达量大且纯度较高的hcGAS和mcGAS蛋白。2、cGAMP的制备与纯化利用大肠杆菌表达合适的二核苷酸环化酶来制备相应的环二核苷酸（CDNs）。通过优化培养基种类、分析诱导温度、时间等因素提高CDNs的初始产量。（1）在大肠杆菌 BL21（DE3）中共表达tDGCm（Thermotoga maritima Diguanylate Cyclase mutant,residues:82-248）与 STINGCTD（人源 STING 羧基末端结构域,residues:149-379）,使用LB培养基,IPTG终浓度为0.1 mM,37℃诱导20 h,发酵得到c-di-GMP的粗品。（2）在大肠杆菌 BL21（DE3）中共表达 DncVtm（Dnc VT179R,residues:1-419）与 GMK（Staphylococcus aureus Guanylate Kinase）、NDK（E.coli nucleoside Diphosphate Kinase）,使用 TB 培养基,IPTG 终浓度为 0.1 mM,18℃ 诱导 20h,发酵得到3’3’-cGAMP的粗品。（3）大肠杆菌 BL21-CodonPlus（DE3）-RIL 表达 SUMO-mcGAS,使用改良的M9极限培养基,IPTG终浓度为0.1 mM,37℃诱导20 h,发酵得到2’3’-cGAMP的粗品,大肠杆菌产生的c-di-GMP和3’3’-cGAMP在菌体内,通过高压破碎、离心、过滤等步骤得到c-di-GMP和3’3’-cGAMP的粗品;产生的2’3’-cGAMP在培养液经过滤得到2’3’-cGAMP的粗品。CDNs的粗品再经STING亲和柱、大孔吸附树脂SP207和C18反相色谱柱纯化,旋蒸、冻干得到铵盐形式的CDNs。（4）HPLC方法鉴定,确定纯化的CDNs不包含杂峰;LC-MS鉴定纯化CDNs的分子量与理论值相符。通过紫外分光光度计法分析测定,c-di-GMP、3’3’-cGAMP和2’3’-cGAMP的重量纯度分别大于99%、96%和99%。每升培养物的收率分别大于 68、26 和 82 毫克。ITC（Isothermal Titration Calorimetry）实验证明制备的CDNs与STING蛋白有较高的亲和力,纯化c-di-GMP和3’3’-cGAMP结合STING的解离常数Kd分别为4.09 μM和5.40 μM,纯化2’3’cGAMP与STING结合为吸热反应,解离常数Kd为16 nM。二、疱疹病毒间质蛋白ORF52的晶体结构及抑制cGAS的机制研究KSHV病毒通过ORF52抑制cGAS活性,但ORF52抑制cGAS活性的结构机制尚不清楚。为了从蛋白结构的角度研究ORF52对cGAS-cGAMP-STING信号的影响,我们首先制备纯化不同种属的ORF52蛋白,随后对鼠疱疹病毒68间质蛋白的晶体生长、对cGAS的调控作用进行探索。1、ORF52同源蛋白的制备纯化利用大肠杆菌系统表达不同来源的ORF52同源蛋白,包括鼠疱疹病毒68（Murine gamma-herpesvirus 68）的间质蛋白 ORF52（Mh52,下文简称 Mh52）,猪疱疹病毒 1 型（Porcine lymphotropicherpesvirus 1）的间质蛋白 ORF52（Por52,下文简称Por52）。所用纯化步包括Ni-NTA亲和层析、强阳离子亲和层析和分子筛,最终得到纯度较高的Mh52和Por52蛋白。2、Mh52的晶体制备及结构解析通过对上述两个ORF52同源蛋白进行晶体筛选,优化,得到Mh52的单晶,并收集得到2.50（?）的衍射数据。再经过分子置换、模型修正,最终解析了 Mh52的三维结构,Rwork、Rfree因子分别为21.08%和26.88%,拉氏图检测显示99.19%氨基酸残基在最佳区,无氨基酸残基落在不允许区。虽然以全长Mh52进行晶体筛选,但所得晶体结构中只包含46-105位氨基酸残基,其N端1-45和C端106-135均由于密度不可见而未搭建。另外尝试共晶的方法对Mh52-dsDNA二元复合物、Mh52-DNA-cGAS三元复合物进行晶体筛选,但均未获得复合物晶体。3、ORF52的功能我们采用Pull-down实验分析Mh52与cGAS的相互作用,以确定Mh52的功能。结果表明,单纯Mh52蛋白与cGAS之间的相互作用较弱,但加入外源DNA后可增强二者间的相互作用。另外,酶活实验结果显示,当Mh52与mcGAS浓度比例≥20:1时,可完全抑制cGAS酶活。由于Mh52蛋白也可以结合dsDNA我们也分析其与dsDNA的结合能力。结果表明,Mh52蛋白与45-59 bp dsDNA亲和力强,而与18-33 bp dsDNA亲和力弱。Mh52对dsDNA的结合无序列选择性,但有长度依赖性。基于这些发现,我们初步推测Mh52蛋白不仅和cGAS竞争结合dsDNA,而且通过直接相互作用影响cGAS对DNA的结合,使cGAS不能被dsDNA有效激活,从而抑制cGAS的活性。三、cGAMP激活磷脂酶CapV的晶体结构基础与功能研究CapV属于Patatin样磷脂酶家族,是一种全新的cGAMP结合蛋白。CapV的活化依赖于cGAMP,因此,我们通过异源表达不同细菌来源的CapV序列,然后进行蛋白纯化、晶体制备,并利用我们前期制备的高纯度3’3’-cGAMP共孵育获得复合物晶体,以确定CapV通过结合cGAMP而发挥免疫应答的分子机制。1、CapV全长蛋白的纯化利用大肠杆菌表达系统,对来源于霍乱弧菌（Vibrio cholerae）的CapV（以下简称vcCapV）和来源于鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii）的CapV（以下简称abCapV）进行表达,将vcCapV和abCapV构建到His-SUMO表达载体上,均获得大量可溶上清蛋白,但vcCapV蛋白性质不够稳定,容易产生多聚体,不利于纯化和后续的晶体条件的搜索。我们通过纯化条件的优化,获得了大量稳定的、聚集状态为二体的abCapV全长蛋白。2、CapV突变蛋白的纯化为了研究CapV蛋白的功能、确定有利于晶体生长的实验条件,我们设计并纯化了 vcCapV和abCapV的突变体,包括vcCapV活性中心突变体（S62A、D201A、D201N）,abCapV 的活性中心突变体（S49A、D174A）,abCapV 二体相互作用关键氨基酸的突变体（W228A）。为了验证abCapV蛋白功能,我们设计并纯化了 abCapV与3’3’-cGAMP相互作用的关键氨基酸突变体蛋白（K133A、E189A、D143A、Y192A、T131A、H258A、L140S、R142G）,以及 C 端截短体（residues:1-310,用 His-MBP 载体表达）。3、abCapV蛋白的结晶及结构解析通过对abCapV进行晶体条件筛选、优化,得到了 abCapV的晶体,使用同步辐射光源收集获得分辨率为2.30 （?）的高分辨衍射数据。然后通过分子置换、模型搭建、结构修正等,获得abCapV的三维结构,Rwork、Rfree因子分别为22.14%和24.43%,拉氏图检测显示96.67%氨基酸残基在最佳区,无氨基酸残基落在不允许区。abCapV以功能二聚体的形式存在,与结晶所用的二体峰以及功能上的二体单位是一致的。abCapV蛋白单体结构与磷脂酶Patatin-17结构类似（RMSD为1.844 （?））,六个β折叠片位于中心起“支架”作用,α螺旋位于两侧,成“三明治”样式。abCapV活性位点与Patatin-17一样属于Ser-Aspcatalytic dyad,均具有与α/β水解酶类似的结构特征。两者三维结构间的主要差异在于三处,包括loop1区（residues:82-92）、loop2区（residues:211-220）和C端（residues:320-340）。4、abCapV与3’3’-cGAMP复合物晶体的结构通过共晶的方法得到了abCapV结合3’3’-cGAMP状态下的晶体,并经过晶体的优化得到了可用于衍射的复合物单晶。使用同步辐射光源收集获得分辨率为2.76 （?）的高分辨衍射数据。然后通过分子置换、模型搭建、结构修正等,获得abCapV-3’3’-cGAMP复合物的三维结构,Rwork、Rfree因子分别为27.04%和29.29%。abCapV在apo和结合3’3’-cGAMP两状态下的三维结构基本相似（RMSD为0.5775 （?））,主要差异在于loop1区。5、abCapV的结构与功能分析通过进一步的结构分析和功能研究,主要得到以下结果:（1）abCapV在晶体结构中和溶液状态下均为二聚体;（2）abCapV以高亲合力（Kd:10.6nM）结合3’3’-cGAMP,比例为2:2,其结合区位于紧邻活性位点的另一空腔中,两者间由α10和α11隔开,参与3’3’-cGAMP相互作用的残基主要包括Glu189、Lys133、Arg142、Leu140、Asp143、His188等保守残基,为一类新的环核苷酸结合方式;（3）酶活位点也为Ser-Aspcatalytic dyad,突变体S49A、D174A均为失活突变体;（4）loop1区对磷脂底物的识别起到关键作用;（5）abCapV催化水解磷脂的分子机制:3’3’-cGAMP的结合促使abCapV的loop1区发生构象变化以及蛋白多聚化,从而使abCapV可以特异识别和结合底物磷脂,进而采用类似经典的cPLA2（Cytosolic Phospholipase A2）磷脂酶的催化机制高效地将磷脂水解成游离脂肪酸。研究结论、创新点、不足结论1、采用低成本的微生物发酵法可高效制备CDNs（c-di-GMP、3’3’-cGAMP、2’3’-cGAMP）。2、Mh52结合dsDNA无序列选择性,有长度依赖性。3、Mh52通过与cGAS相互作用,以及竞争结合dsDNA方式,进而抑制cGAS酶的活性。4、abCapV蛋白整体结构与磷脂酶Patatin-17结构类似,基本上呈三层的α/β/α模式。5、abCapV与3’3’-cGAMP结合区位于紧邻活性位点的另一空腔中,两空腔由α10和α 11隔开,为一类新的3’3’-cGAMP结合蛋白。6、3’3’-cGAMP的结合促使abCapV的loop1区发生构象变化以及蛋白多聚化,进而采用类似cPLA2磷脂酶的催化机制高效水解底物磷脂。创新点1、首次报道用微生物发酵方法制备高纯度的CDNs。2、首次确定Mh52通过竞争性抑制的方式,通过结合dsDNA抑制cGAS与dsDNA的结合能力,从而抑制cGAS活性;且Mh52倾向于结合45-59bp的dsDNA,但对结合序列无选择性。3、首次报道磷脂酶abCapV晶体结构及其与3’3’-cGAMP复合物晶体结构,明确了 abCapV与3’3’-cGAMP的结合位点,推测了 abCapV水解磷脂的机制。不足之处1、因Mh52蛋白容易降解,未能得到Mh52全长蛋白晶体,需进一步优化晶体筛选的条件,此工作需进一步研究。2、Mh52-dsDNA二元复合物、Mh52-DNA-cGAS三元复合物晶体筛选条件需进一步研究。3、abCapV与3’3’-cGAMP结合后水解磷脂的具体机制需进一步研究。