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禽致病性大肠杆菌(Avain Pathogenic Escherichia coli,APEC)APECTW-XM和新生儿脑膜炎大肠杆菌(Neonatal Meningitis Escherichia coli,NMEC)分别在禽类脑膜炎和新生儿中发挥重要作用,挑战人类健康以及畜禽养殖业发展。使用生物信息学比较NMEC和APECTW-XM的基因组,发现它们都属于B2系统组和95多基因座序列分型复合体(ST95),在其基因组DNA、氨基酸序列和蛋白质水平上高度同源、存在许多相似的毒力因子,并且具有相同的动物感染模型,这些表明APEC TW-XM具有潜在的公共卫生意义。温度敏感型血凝素(Temperature-sensitive hemagglutinin,Tsh)是禽致病性大肠杆菌的重要组分之一,作为重要的黏附素和关键的毒力因子可介导细菌与宿主细胞相互作用。Tsh在革兰氏阴性菌的进化中是高度保守的,在过去的几十年中,已经对APEC中Tsh的结构、功能和表达进行了广泛的研究。研究表明它能够促进细菌对禽呼吸道等上皮细胞的黏附,在APEC黏附和侵袭宿主中发挥关键作用。多位点序列分型和毒力质粒检测发现,Tsh是APECTW-XM和NMEC的共同毒力靶标并且氨基酸序列高度同源,因此探究APECTW-XM中Tsh的功能对预警人畜共患病的潜在风险具有重要意义。本研究以Tsh为切入点,探究其在APECTW-XM病原菌感染宿主过程中的致病机制。首先,本研究在NCBI GenBank上比对相关的引起脑膜炎的大肠杆菌菌株的tsh基因序列,设计一对引物对APEC TW-XM中tsh基因进行PCR扩增,然后将其克隆至pBR322表达载体中,再转化至大肠杆菌DH5α中表达Tsh蛋白。通过血细胞凝集试验验证了 Tsh对红细胞的凝集活性,证实了 Tsh存在于APEC TW-XM中。然后通过利用血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)的体外模型小鼠的脑微血管内皮细胞(mouse brain microvascular endothelial cells,bEnd.3)检测APECTW-XM在低温(26℃)、哺乳动物体温(37℃)以及禽体温(42℃)三个培养温度下对bEnd.3细胞的黏附情况。黏附结果显示,在禽体温(42℃)条件下,APECTW-XM菌株对bEnd.3细胞的黏附能力最强,给后续的体外试验提供理论支撑。为了探究Tsh对APEC TW-XM穿越bEnd.3细胞的影响,基于tsh基因序列,利用λ-Red同源重组系统和基因克隆技术构建APEC TW-XM菌株中编码基因tsh的缺失菌株和回补菌株。生长曲线显示,Tsh的缺失不影响APEC TW-XM的生长规律,同时也排除了动态生长规律不同对后续试验中各结果的影响。bEnd.3细胞黏附侵袭结果显示,与野生株相比,在30、37、42℃时APEC TW-XMΔtsh缺失株对bEnd.3 细胞的黏附侵袭能力显著下降(0.005<P<0.01),42℃时影响最显著,回补株感染组的黏附能力与野生组无统计学差异(P>0.05)。作为影响破坏BBB功能的炎症因子,常被用来作为检测病原菌黏附入侵BBB的参数,因此,本研究用qRT-PCR检测了三个不同温度下感染bEnd.3细胞后炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。实验结果表明,与野生株感染组相比,tsh基因缺失株感染组bEnd.3细胞内IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子的表达在转录水平显著下降,42℃时下降最显著,回补株感染组的侵袭能力与野生组无统计学差异(P>0.05)。Collagen Ⅳ和fibronectin是Tsh蛋白的结合蛋白,可以介导Tsh对呼吸道上皮细胞的黏附。为了进一步探究Tsh蛋白如何促进APEC TW-XM对bEnd.3细胞的黏附,本研究使用qRT-PCR检测了三个不同温度下感染bEnd.3细胞后collagen Ⅳ和fibronectin的表达。结果显示,与野生株感染组比较,缺失株感染组bEnd.3细胞中collagen Ⅳ、fibronectin的表达显著下降,42℃时下降最显著,回补组与野生组相比无统计学差异(P>0.05)。以上体外实验结果表明,Tsh可以通过诱导collagenⅣ、fibronectin的表达,来促进APECTW-XM黏附侵袭bEnd.3细胞,并且引起细胞内促炎因子的表达。为了进一步探究Tsh对APEC TW-XM病原性和致脑膜炎的影响,本研究通过建立APEC TW-XM致脑膜炎的动物模型,比较了 APEC TW-XM野生株、APEC TW-XMΔtsh缺失株和APEC TW-XMΔtsh/ptsh回补株感染小鼠后,小鼠神经症状、死亡率、BBB完整性、脑组织病理情况及collagen Ⅳ、fibronectin蛋白表达的变化。通过观察和评分脑膜炎的临床神经症状,本研究成功建立了APEC TW-XM致脑膜炎的小鼠模型,缺失株感染组小鼠神经症状减轻。小鼠感染实验发现,感染缺失株的小鼠死亡率显著下降。野生株、缺失株与回补株感染组的死亡率分别为100%(10/10)、66%(8/12)、92%(11/12)。细菌定植结果表明,与野生株感染组的小鼠相比,缺失株感染组小鼠的血、脑、心、肝、脾、肺中细菌数明显减少(P<0.01)。利用尾静脉注射伊文思蓝(Evans Blue,EB)染料的方法测定小鼠BBB完整性破坏程度,结果表明,缺失株感染组大脑染色程度显著低于野生株和回补株感染组。病理切片结果显示,与缺失组相比,野生组和回补株组的小鼠脑中出现明显的脑膜增厚和中性粒细胞浸润等组织病理学病变。用qRT-PCR分别检测了野生株、缺失株和回补株感染后脑组织中炎症因子及Tsh结合蛋白collagen Ⅳ、fibronectin的表达情况,结果发现,与野生株感染组相比,缺失株感染后脑组织中IL-1β、IL-6和TNF-α显著降低了 81.2%、78.5%、82.1%(P<0.01);collagenⅣ、fibronectin 的表达降低了 83.3%、66.7%,差异显著(P<0.01)。进一步通过免疫组化实验来探究感染后小鼠脑组织血管上collaganⅣ和fibronectin的表达量和分布情况。结果显示,与野生组相比,缺失组脑组织血管内皮细胞上的collagenⅣ、fibronectin表达量均显著降低。以上结果与体外实验结果一致,证明Tsh影响APEC TW-XM突破BBB并引起脑膜炎的致病能力。通过体外和体内实验结果表明,Tsh可以通过上调collagen Ⅳ和fibronectin的表达,促进APEC TW-XM在脑部的定植以及黏附侵袭BBB,侵入中枢神经后诱导促炎因子大量产生,从而引起细菌性脑膜炎的发生。