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小细胞肺癌(SCLC)是支气管黏膜上特殊类型的肺癌。SCLC细胞具有倍增速度快、恶性程度高、早期转移等特点,这导致SCLC临床治愈率较低。目前常规化疗或放疗对SCLC疗效有限,仍缺乏有效的靶向治疗手段。因此,进一步研究SCLC的病理生理机制并发现新的治疗靶点尤为重要。Nudix羟化酶(NUDTs)是病毒,细菌和真核生物中广泛存在的超家族。NUDTs能催化多种反应,如可变剪接、选择性聚腺苷酸化、ADP-核糖响应转录调控和ADP-核糖响应钙通道的形成等。NUDTs还可以“清理核苷酸库”防止非经典碱基掺入DNA。NUDTs在人类基因组中共有24个成员,在细胞代谢与重编程等方面发挥重要作用。NUDT21又称CFIm25或CPSF5,是NUDTs家族的一员,其四级结构为同型二聚体。NUDT21是3’UTR缩短的主要调控因子,通过调节3’UTR长度变化以改变选择性聚腺苷酸化与可变剪接功能。NUDT21调控的选择性聚腺苷酸化在细胞增殖、细胞分化中有重要作用。NUDT21可以通过调控线粒体谷氨酰胺酶1(GLS1)参与肿瘤谷氨酰胺代谢。GLS1有两种亚型即:肝谷氨酰胺酶C(GAC)和肾谷氨酰胺酶(KGA)。GAC具有较高的催化活性,在许多类型的肿瘤中发挥主导作用。GAC与KGA比值的异常变化可以反映某些疾病的代谢特征。以往研究证实NUDT21能够在转录后水平调节蛋白质的形成,并与多种疾病密切相关,包括血液病、免疫疾病、内分泌疾病和肿瘤等。这些疾病都涉及异常的谷氨酰胺代谢。本论文阐明了NUDT21在SCLC样本中的表达情况及NUDT21对SCLC细胞体内外生物学特性的影响,并揭示了NUDT21通过调控线粒体谷氨酰胺酶1的可变剪接来参与谷氨酰胺代谢的机制。一、SCLC细胞低表达NUDT21并受低氧微环境影响首先,通过SCLC样本的免疫组织化学染色法的结果分析,发现在15对样本中NUDT21表达下调。我们考虑NUDT21的低表达是否影响肺癌患者的生存率,再通过TCGA数据集分析发现NUDT21影响临床肺癌患者的生存率,NUDT21低表达肺癌患者的生存期缩短。因此,我们推论NUDT21表达与肺癌患者生存率相关。其次,由于NUDT21与代谢相关,肿瘤代谢受微环境影响,因此我们考虑构建缺氧微环境来讨论SCLC是否受NUDT21的影响。结果表明SCLC细胞中NUDT21表达与低氧相关性。A549细胞在缺氧培养下NUDT21表达发生改变并与低氧时间有关。低氧诱导因子HIFs随时间延长而表达逐渐上调;短时间低氧诱导NUDT21表达上调,而长时间(24小时)时间低氧导致NUDT21表达下调。这说明缺氧微环境调节SCLC细胞NUDT21的表达水平。通过转导干涉HIFs载体后48小时检测NUDT21表达,结果干涉HIF-1α的表达后明显影响NUDT21的表达;干涉HIF-2α后NUDT21表达无差异变化。进一步表明NUDT21的表达受HIF-1α的介导。因此我们设计并构建了干涉NUDT21表达的慢病毒载体PLKO.1-sh NUDT21及对照载体scramble,通过293T细胞转染方法制备了相应重组慢病毒,用于干涉A549细胞NUDT21的表达,以此进一步探讨NUDT21在SCLC细胞中的作用。二、NUDT21对SCLC细胞体外生物学特性的影响确定NUDT21在SCLC细胞增殖、克隆形成、凋亡、周期等生物学特性中的影响。将干涉NUDT21及高表达NUDT21的慢病毒转导A549细胞后进行生物学特性分析,结果发现PLKO.1-sh NUDT21促进了A549细胞的增殖并抑制A549细胞的凋亡。细胞周期分析结果表明沉默NUDT21后G2M期显著升高。克隆形成实验结果表明PLKO.1-sh NUDT21组形成的细胞克隆数明显多于PLKO.1-scramble对照组,验证了沉默NUDT21后促进A549细胞增殖结论。我们通过Trans-well实验发现A549在低氧情况下迁移能力增强,而高表达NUDT21则抑制A549细胞的增殖。通过NUDT21影响SCLC细胞生物学特性的结果提示在SCLC中NUDT21扮演着抑癌基因作用,并可能与低氧调控有关。三、NUDT21沉默促进SCLC细胞体内增殖基于干涉NUDT21及高表达NUDT21对肺癌A549细胞的体外生物学效应的结果,进一步通过小鼠体内异种移植模型研究A549细胞沉默NUDT21及高表达NUDT21对小鼠成瘤的影响。对小鼠的成瘤过程及对小鼠肿瘤分析,结果表明沉默NUDT21组小鼠肿瘤生长最快,高表达NUDT21组低于沉默NUDT21组;在实验过程中体重无统计差异性的变化。试验结束后对小鼠进行安乐死并取出肿瘤进一步分析,各组肿瘤称重发现沉默NUDT21组肿瘤重量明显高于对照组,高表达NUDT21低于对照组;并明显看出各组的肿瘤体积差异。然后通过免疫组织化学分析各组肿瘤中NUDT21的表达,沉默NUDT21组明显低于对照组,高表达组相对于对照组更高。因此在体内也验证了沉默NUDT21促SCLC细胞增殖的特性。这说明NUDT21在SCLC细胞生长过程中极为重要,这可能也是NUDT21在SCLC中低表达促进肿瘤生长导致肺癌患者生存率降低的原因。四、NUDT21影响SCLC细胞侵袭及调控GLS1可变剪接参与谷氨酰胺代谢NUDT21表达与SCLC细胞缺氧微环境相关,这与肿瘤的代谢及侵袭关系密切。进一步揭示NUDT21通过GLS1可变剪接调控SCLC细胞谷氨酰胺代谢及NUDT21抑制SCLC转移。对干涉NUDT21及高表达NUDT21慢病毒转导A549细胞,并且A549在正常条件及低氧微环境中处理进行分析。结果低氧微环境中Glut1和Glut3表达上调,干涉NUDT21也显著升高A549细胞中Glut1表达,并通过JC-1检测发现干涉NUDT21促进糖代谢功能。RT-PCR与蛋白印迹法鉴定了GLS1及两种亚型GAC、KGA的表达情况,结果GLS1表达下调,同时GAC也随之下调,KGA表达升高;同时GAC/KGA比值降低。随后蛋白印迹法表明低氧微环境中HIF-1a上调,NUDT21下调,并且E-cadherin下调,Vimentin上调。A549细胞干涉NUDT21后和低氧环境下结果一致,揭示NUDT21可抑制SCLC的EMT。上述结果表明NUDT21调控SCLC细胞的生长与代谢的同时也影响着SCLC的转移。综上所述,我们揭示了NUDT21对肺癌患者生存率及SCLC细胞生长的重要影响,同时表明NUDT21在SCLC转移及代谢中扮演着重要角色。本研究阐明了NUDT21在影响SCLC发生发展中的病理生理学作用,为推进NUDT21基因用于SCLC诊断和治疗提供了新思路,并可能提供了治疗新策略。