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目的:了解林蛙主产区的人工驯养现状及存在的问题,制定动物药材哈蟆油的生产及产地加工技术规程草案。通过对林蛙和蟾蜍的输卵管进行性状特征、显微结构、理化性质、化学成分、药效作用方面的对比,分析两者的异同点,对蟾蜍油的毒性成分及急性毒性进行研究,以期为蟾蜍油资源利用提供实验依据。材料与方法:考察对象与材料辽宁、吉林两省具有一定规模的中国林蛙驯养企业;不同产地的哈蟆油样品2批,蟾蜍油样品9批。方法:1中国林蛙人工驯养情况调查实地考察重点对林蛙的生态环境与人工驯养中的孵化、繁育、放养、越冬,以及哈蟆油药材的生产及产地加工等各阶段进行实地调查。主要关注人工驯养中的产卵期繁育技术、蝌蚪期幼体食物饲养、病虫害防治、夏季幼蛙放养、越冬期,以及哈蟆油生产与产地加工技术等内容。2哈蟆油与蟾蜍油对比研究2.1药材对比研究观察哈蟆油和蟾蜍油完整干燥样品,观察二者性状特征;采用普通光学显微镜,观察哈蟆油和蟾蜍油的腺体细胞显微结构,比较细胞形态上的异同;按《中国药典》四部中膨胀度测定法(通则2101)测定二者膨胀度。2.2化学成分对比研究采用分光光度法,对二者的水溶性蛋白质和总磷脂含量进行对比研究;采用HPLC法对二者的1-MH、氨基酸类成分、核苷类成分、磷脂类成分、胆固醇类成分、雌二醇类成分含量进行对比研究。2.3药效作用对比研究采用小鼠游泳实验模型进行抗疲劳药效作用对比,采用小鼠缺氧实验模型进行耐缺氧药效作用对比,并对结果进行统计学分析。2.4蟾蜍油毒性成分测定及急性毒性实验2.4.1蟾蜍油中华蟾酥毒基含量测定以华蟾酥毒基为对照品,采用HPLC法,测定蟾蜍油中华蟾酥毒基成分的含量2.4.2蟾蜍油样品进行急性毒性实验参照《GB 15193.3-2003食品安全性毒理学评价程序》进行急性毒性试验。结果:1中国林蛙人工驯养情况调查林蛙养殖目前处于半人工驯养状态。孵化与繁育技术日益完善,病虫害的防治手段既有有效的预防措施也有针对性的治疗手段,放养期在深林中处于天然放养状态,越冬主要依靠自然环境条件和哈蟆池,技术较为完善。哈蟆油药材目前采用的方法有晾晒剥取、冷冻剥取、新鲜剥取。2哈蟆油与蟾蜍油对比研究2.1药材对比哈蟆油和蟾蜍油干燥样品在外观上具有明显差异,哈蟆油呈块状有特异性窝沟,蟾蜍油呈鸡肠状弯曲多层重叠,二者气味都微腥,但哈蟆油气腥,味微甘,蟾蜍油则有腥臭味;哈蟆油和蟾蜍油腺体细胞显微结构相近,但哈蟆油细胞细胞核和细纹相对较多;蟾蜍油膨胀度平均值为48.1,哈蟆油膨胀度平均值为68.4,蟾蜍油均低于哈蟆油。2.2化学成分对比2.2.1哈蟆油和蟾蜍油的差异性成分是水溶性蛋白质与雌二醇。2.2.2哈蟆油和蟾蜍油的相似性成分是:1-MH、氨基酸、核苷类、磷脂类成分及胆固醇。2.3药效作用对比研究哈蟆油可延长小鼠游泳时间,蟾蜍油组与空白组无统计学差异,但有增加小鼠运动时间的趋势。哈蟆油可延长小鼠耐缺氧时间,蟾蜍油组与空白组无统计学差异,但可明显延迟小鼠出现呼吸急促的现象。2.4蟾蜍油毒性成分测定及急性毒性实验2.4.1蟾蜍油中华蟾酥毒基含量测定在《中国药典》的实验条件下,未检出华蟾酥毒基。2.4.2蟾蜍油样品进行急性毒性实验经过连续14日观察。雌雄小鼠活动正常,睡眠正常,进食进水情况正常,未见不良反应。结论:1综合调查显示,哈蟆油药材其生产及产地加工过程中存在一定问题,为了促进行业发展,制定了《动物药材生产及产地加工技术规程哈蟆油》标准草案。2蟾蜍油与哈蟆油的共性及差异:2.1蟾蜍油与哈蟆油的相似:蟾蜍油的腺体细胞结构与哈蟆油相似,化学成分上磷脂类、核苷类、胆固醇、1-MH、氨基酸含量并无明显差异,蟾蜍油中氨基酸含量更具有营养价值。2.2蟾蜍油与哈蟆油的差异:化学成分中水溶性蛋白质和雌二醇含量具有明显差异。在抗疲劳和抗应激药效作用上,蟾蜍油虽无显著效果但有呈现效果的趋势。3蟾蜍油中未检测出毒性成分华蟾酥毒基,且急性毒性未见不良反应,故蟾蜍油口服具有一定程度的安全性。