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背景:牙周炎是以牙周结缔组织破坏和牙槽骨吸收为特点的一种慢性炎症性疾病,其发病率高达80%以上,其不仅影响牙齿功能,还可作为类风湿性关节炎、不良妊娠、动脉粥样硬化、糖尿病、癌症、眼科疾病和肝脏疾病等疾病的危险因素而危害全身健康。.巨噬细胞是对侵入机体的细菌及其产物产生最初免疫应答的细胞之一,作为组织固有免疫系统的重要组成部分,一方面发挥防御功能,维持牙周组织稳态;另一方面又能够通过释放各种促炎细胞因子,导致牙周组织破坏及牙槽骨吸收。Smad7是一种广泛表达于巨噬细胞等免疫细胞中的TGF-β家族下游信号转导蛋白,通过直接激活巨噬细胞中的IKK-β启动子,释放大量如TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子促进炎症,同时IKK-β还可促进Smad7蛋白的表达,从而形成一条正反馈循环通路,进一步加剧组织的免疫炎症反应。Mongersen作为一种Smad7新型反义寡核苷酸,可通过抑制巨噬细胞内Smad7蛋白的表达抑制炎症。因此,推测Smad7在牙周组织破坏过程中起到关键作用,而mongersen可通过抑制Smad7蛋白的表达进而调控其相关下游信号通路,抑制相关促炎细胞因子的释放,从而达到治疗牙周炎的目的,因此本研究将为牙周炎的治疗开辟新思路。方法:1、Pg-LPS对巨噬细胞表达Smad7的影响用不同浓度Pg-LPS(1μg/mL、5μg/mL、10 μg/mL)刺激处于对数生长期的RAW264.7不同时间(3h、6h、12h、24h),提取细胞样本总RNA,采用实时荧光定量PCR法检测Smad7基因的表达情况,然后检测Smad7基因表达较高时蛋白的表达情况。2、Mongersen抑制巨噬细胞内Smad7蛋白的表达(1)使用Lipo2000将带有Cy-5标记的mongersen转染至RAW264.7内,通过流式细胞术(FCM)确定转染效率;(2)提取细胞样本总蛋白,采用Western Blot法检测Smad7蛋白的表达水平。3、Mongersen对巨噬细胞内促炎细胞因子的影响(1)使用mongersen转染后,采用最适浓度Pg-LPS刺激RAW264.7,3h、6h、12h、24h后分别提取细胞样本总RNA,采用实时荧光定量PCR法检测细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、IL-10和TGF-β1的mRNA表达水平;(2)方法同上,3h、6h、12h、24h后收集细胞培养上清液,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定上述细胞因子的蛋白分泌量。结果:1.不同浓度Pg-LPS(1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL)与RAW264.7细胞共培养3h、6h、12h、24h后,在12h,Pg-LPS浓度为5 μg/mL时,Smad7基因的表达明显升高,其他条件下Smad7基因表达水平无显著变化,无统计学意义。当12h,Pg-LPS浓度为5 μg/mL时Smad7蛋白的表达与对照组相比明显升高。2.将带Cy-5荧光标记的mongersen转染至RAW264.7后,流式细胞术检测转染效率可达76.57%。Western Blot结果显示实验组Smad7蛋白表达可明显降低。证实Lipo2000载mongersen在RAW264.7中具有较好的转染效率,并可明显抑制Smad7蛋白的表达。3.使用mongersen转染RAW264.7后,在Pg-LPS与RAW 264.7细胞共培养不同时间后,与对照组相比,实验组促炎细胞因子IL-6基因和蛋白的表达在不同时间点均明显降低,IL-1β、TNF-α和iNOS基因和蛋白的表达仅在6h或12h降低较为明显;抗炎细胞因子TGF-β1在6h和12h时基因的表达降低明显,而蛋白无明显变化,IL-10基因和蛋白均无明显变化。结论:1.Pg-LPS刺激巨噬细胞后可促进Smad7基因和蛋白表达的升高;2.Mongersen可通过抑制Smad7蛋白的表达进而抑制促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。