背景miRNAs是一类内源性非编码的长约18-25nt的RNA分子，它们可以通过与靶基因的结合，抑制靶基因的翻译或者使靶基因降解，从而对靶基因起到负性调节作用，在生物体内发挥着重要作用，是基因表达的重要调节分子。到目前为止，在动物和植物体内已经发现了数以千计的miRNAs分子，越来越多的研究证明，miRNAs分子对生命过程的调节几乎涉及到生命活动各个方面，对细胞的调节则包括生长、增殖、分化、发育和死亡等细胞程序的每一步骤。其中，细胞的分化和细胞的增殖是细胞程序中比较重要的环节，因此，miRNAs分子在肿瘤和干细胞中的作用研究是其功能研究的热点。骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，常发生于儿童或者青少年，预后不好。近年来，随着更有效的新型化疗药物的产生以及保肢手术的发展（例如我科的微波灭活保肢手术），骨肉瘤的治疗水平有很大提高。但是，发生转移和复发的患者预后仍然很差，而且和化疗相关的获得性耐药和继发性的转移肿瘤的发生依然是比较严重的问题。因此，对于骨肉瘤的耐药和恶性发展相关的基因或者通路的确定对于提高骨肉瘤的治疗水平至关重要。本研究将近年来研究的明星分子miRNAs分子和本实验室的特色骨肉瘤结合起来，深入研究miRNAs分子对骨肉瘤细胞的生物学特性的的影响，尤其是对骨肉瘤耐药性方面的影响。通过参考大量的文献，我们发现miR-221在很多人类肿瘤中是高表达的，越来越多的实验结果表明：miR-221在人类肿瘤细胞中扮演癌基因的角色。但是，miR-221在人骨肉瘤中的作用尚未研究。本实验以miR-221作为主要研究目标，研究其在两种骨肉瘤细胞系SOSP-9607和MG63中的作用及其机制。目的通过对miR-221在骨肉瘤中的作用及作用机制的研究，揭示miR-221分子对骨肉瘤生物学性状和耐药性的影响，为临床骨肉瘤治疗和耐药性的预防提供治疗靶点和理论依据，并为进一步的实验奠定实验基础。方法（1）为研究miR-221在骨肉瘤中的作用，利用实时定量PCR测定miR-221在5种骨肉瘤细胞系SOSP-9607，MG63，U2OS，Saos-2和SOSP-9901以及成骨细胞系hFOB1.19中的表达量，观测是否有差异。（2）在SOSP-9607和MG63两种细胞系中，转染miR-221的模拟物和抑制物来上调和下调miR-221的表达量。对照组为空白（不转染任何核苷酸）对照组。（3）在两种细胞系中，通过上调和下调miR-221的表达量，检测miR-221对两种细胞增殖（MTT法）、周期（流式细胞仪法）、凋亡（流式细胞仪法）的影响。（4）在两种细胞系中，检测miR-221表达量的变化对细胞对顺铂的耐药性的影响。（5）通过生物信息学方法检索miR-221的靶基因，并利用荧光基因报告系统验证该预测靶基因是否是miR-221的靶基因。并通过转染不含靶基因的3’-UTR（非编码端）片段的靶基因质粒和靶基因通路的抑制剂进一步验证miR-221的作用通路（。6）在骨肉瘤标本中检测miR-221和其靶基因表达量的相关性，将实验结果和临床结合。结果（1）实时定量PCR检测miR-221表达量，结果显示：miR-221在骨肉瘤中的表达量明显高于在成骨细胞系中的表达量（每组的倍数均>2.5且p<0.001），而且在MG63中的表达量最高，在SOSP-9607中的表达量最低，所以本实验选取MG63和SOSP-9607细胞系作为实验对象。（2）荧光显微镜结果显示，miR-221的模拟物和抑制物能够有效的转染进细胞中，而且转染效率大于80%。转染后，实时定量PCR检测miR-221表达量，结果显示：在骨肉瘤细胞系SOSP-9607中与对照组相比，miR-221模拟物能够显著上调miR-221的表达量（上调倍数约等于360倍，p<0.001），同时，miR-221抑制物能够明显降低miR-221的表达量（降低倍数约为65倍，p<0.001）。在MG63中，得到相似的实验结果，升高和降低的倍数分别为290倍（p<0.001）和45倍（p<0.001）。（3）在SOSP-9607和MG63两种细胞系中，转染miR-221模拟物的细胞均增殖明显加快，并且具有最低的G0/G1期细胞比率（SOSP-9607：p=0.001；MG63:p=0.017），同时具有最高的S期细胞比率（SOSP-9607： p=0.001；MG63:p=0.005）；相反，转染miR-221抑制物的细胞增殖明显减慢，并且具有最高的G0/G1期细胞的比率（SOSP-9607：p=0.009；MG63:p=0.032），同时具有最低的S期细胞比率（SOSP-9607：p=0.005；MG63:p=0.008）。（4）在SOSP-9607和MG63两种细胞系中，miR-221模拟物均可以明显降低顺铂引起的细胞毒性，从而提高细胞对顺铂的耐药性。并且，miR-221在不同浓度的顺铂条件下均保持着这种提高肿瘤细胞耐药性的作用。相反，miR-221抑制物可以明显增加顺铂引起的细胞毒性，从而明显降低细胞对顺铂的耐药性，而且此作用在不同浓度的顺铂条件下均体现。同时，作为细胞凋亡重要的调节因子的caspase3的活性可以明显的被miR-221模拟物抑制而被miR-221抑制物增强。（5）通过生物信息学方法，预测PTEN为miR-221靶基因之一，将PTEN基因含有miR-221作用靶点的3’-UTR克隆到荧光报告基因系统中并和miR-221模拟物或者抑制物共转染进两种肿瘤细胞中，研究发现，与对照组相比，miR-221模拟物可以明显降低载有PTEN基因3’-UTR的荧光报告基因的荧光强度，相反，miR-221抑制物可以明显增强其强度。并且，Western blot检测显示PTEN相关的PTEN/PI3K/Akt通路中的蛋白在miR-221模拟物和抑制物的影响下均有所改变。进一步研究显示，与对照组比较，只包含PTEN基因的开放阅读框（不包含PTEN基因3’-UTR）的pcDNA质粒转染进SOSP-9607细胞后可以消除使miR-221模拟物对PTEN蛋白水平影响，从而消除miR-221模拟物对细胞耐药性的影响。同时，PI3K/Akt抑制剂也可以阻断miR-221模拟物对PTEN/PI3K/AKT通路的影响从而对肿瘤细胞耐药性产生作用。（6）25例骨肉瘤毗邻组织和60例骨肉瘤组织（36例原发和24例复发）检测显示，实时定量PCR检测显示，miR-221在骨肉瘤中的表达量明显高于在毗邻组织中的表达量（p<0.001），而且在复发肿瘤组织中表达量明显高于在原发肿瘤表达量（p<0.05）。免疫组化显示60例骨肉瘤中PTEN基因的表达量和miR-221呈明显的负相关性（p<0.001）。结论（1）miR-221在骨肉瘤细胞系中表达量明显高于在成骨细胞系中的表达量。（2）人工合成的miR-221模拟物和抑制物可以有效地转染进SOSP-9607和MG63细胞中，并且有效的调节内源性miR-221的表达量。（3）miR-221促进骨肉瘤细胞的增殖，抑制肿瘤细胞凋亡，促进细胞周期完成，具有癌基因的作用。（4）miR-221可以明显抑制顺铂对两种肿瘤细胞的毒性作用，提高细胞对顺铂的耐受。（5）miR-221通过靶基因PTEN及其通路在细胞中发挥作用，不包含3′-UTR端的PTEN质粒和PI3K/AKT通路抑制剂可以降低或者阻断miR-221在肿瘤细胞中的作用。（6）在临床标本中，miR-221在恶性肿瘤中表达量明显高于在毗邻组织中的表达量并且和miR-221和其靶基因的表达呈负相关。