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目的丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)广泛应用于各工业生产活动中,职业人群长期暴露于ACR可发生感觉-运动型周围神经病。相关研究表明:ACR中毒可致神经组织内神经丝(Neurofilaments,NFs)异常磷酸化。钙蛋白水解酶(Calpain)依赖Ca2+激活,可改变蛋白激酶活性。蛋白激酶可磷酸化修饰NFs,从而影响其组装、解聚及转运。因此,我们推测ACR所致的神经丝异常磷酸化与calpain介导的蛋白激酶改变相关,建立神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)ACR中毒及钙蛋白酶抑制剂Calpeptin(CP)干预模型,测定细胞内NFs的磷酸化水平,calpain、蛋白激酶A(Protein Kinase A,PKA)、蛋白激酶 C(ProteinKinase C,PKC)及周期素依赖性蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase 5,Cdk5)含量,以探讨ACR致NFs异常磷酸化的机制及CP对其的干预作用,为预防和治疗ACR中毒提供理论依据。方法1 NSCs的原代培养与鉴定无菌条件下,取新生Wistar乳鼠(24h内)的脊髓背根神经节(Dorsal Root Ganglion,DRG)进行原代培养。NSCs鉴定:免疫荧光法检测NSCs特异性表达巢蛋白(Nestin)、神经元特异性表达烯醇化酶(Neuron Specific Enolase,NSE)及神经胶质细胞特异性表达胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)。2实验模型的建立原代细胞培养至第4天,细胞处于生长对数期,将其分为4组:空白对照组(仅完全培养基)、CP对照组(4μmol/LCP)、ACR染毒组(760μmol/LACR)、经CP干预的ACR染毒组(760μmol/L ACR及4μmol/L CP)。处理时间为48h。3免疫荧光法测定NFs磷酸化水平,并观察其胞内分布。4 Western blot 法分析 NSCs 中磷酸化的神经丝(p-NF-H)、μ-calpain、m-calpain、PKA、PKC及Cdk5的含量。5应用SPSS 21.0软件进行统计学分析,组间两两比较用Dunnett-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1 NSCs的原代培养与鉴定NSCs原代细胞24h内贴壁,第3d开始进入快速生长期,生长旺盛,6～7d可长满100cm2细胞培养皿底部。免疫荧光染色显示,90%以上原代培养的NSCs呈Nestin阳性。相同来源的细胞经1μmol/L的维生素A诱导分化,可呈NSE阳性及GFAP阳性。2 NFs磷酸化水平改变2.1免疫荧光定性分析与空白对照组组比,CP组无明显改变;ACR组荧光强度增加,除胞体与核周分布外,轴突中亦分布;ACR+CP组荧光强度相近,胞体与核周皆有分布,轴突中亦有少量分布。与ACR模型组比,ACR+CP组荧光强度稍有降低,轴突中分布减少。2.2 p-NF-H含量改变与空白对照组比,CP组无明显改变;ACR组p-NF-H含量上升67.3%(P<0.05);ACR+CP 组p-NF-H含量上升 32.3%(P<0.05)。与 ACR模型组比,ACR+CP组 p-NF-H 含量下降 35%(P<0.05)。3 calpain含量改变3.1 μ-calpain 含量改变与空白对照组组比,CP组无明显改变;ACR组μ-calpain含量上升56.1%(P<0.05);ACR+CP 组 μ-calpain 含量降低 3.3%(P>0.05)。与 ACR 组相比,ACR+CP组的μ-calpain 含量降低 59.4%(P<0.05)。3.2 m-calpain含量改变与空白对照组组比,CP组无明显改变;ACR组m-calpain含量上升121.7%(P<0.05);ACR+CP 组 m-calpain 含量升高 74.1%(P<0.05)。与 ACR 组相比,ACR+CP 组 m-calpain 含量降低 47.6%(P<0.05)。4蛋白激酶含量改变4.1 PKC含量改变与空白对照组组比,CP组无明显改变;ACR组PKC含量下降23.6%(P<0.05),ACR+CP 组 PKC 含量降低 0.9%(P>0.05);与 ACR 组相比,ACR+CP 组 PKC含量上升22.7%(P<0.05)。4.2 PKA含量改变与空白对照组组比,CP组无明显改变;ACR组PKA含量下降23.0%(P<0.05),ACR+CP组PKA含量升高(P>0.05);与ACR组相比,ACR+CP组PKA含量上升 29.8%(P<0.05)。4.3 Cdk5含量改变与空白对照组组比,CP组无明显改变;ACR组Cdk5含量上升64.6%(P<0.05);ACR+CP 组 Cdk5 含量升高 49.4%(P<0.05);与 ACR 组相比,ACR+CP 组 Cdk5含量下降 15.2%(P>0.05)。结论1.成功建立了神经干细胞ACR中毒及CP干预模型。2.ACR可致神经干细胞NFs磷酸化水平异常,CP能够干预这种改变。3.ACR所致NFs异常磷酸化可能与calpain介导的PKA、PKC改变相关,CP通过干预calpain、PKA及PKC改变拮抗ACR中毒。