论文部分内容阅读
背景骨性关节炎是中老年人中常见的一种慢性退行性病变，以关节退行性变和轻度紊乱，并伴有关节软骨进行性损伤为主要特点，虽病因不同，但具有相似的生物学、形态学和临床表现，其中，膝关节是最容易受累的部位，导致关节慢性疼痛、功能障碍，甚至丧失劳动能力，严重危害中老年人中生活质量，给家庭和社会带来沉重负担。目前，骨性关节炎的临床治疗主要以一线药物对的应用为主，但长期服用会带来一系列弊端，甚至加重病情，因此，寻找有效且副反应少的治疗药物显得尤为重要。本研究利用动物模型将二线治疗药物盐酸氨基葡萄糖与中药姜黄素进行联合治疗膝关节骨性关节炎，对软骨细胞凋亡及凋亡相关基因的影响进行了探讨。目的构建大白兔膝骨关节炎模型，研究膝关节骨性关节炎软骨细胞凋亡情况，分析盐酸氨基葡萄糖和盐酸氨基葡萄糖联合姜黄素对膝关节软骨细胞凋亡的影响，探讨盐酸氨基葡萄糖和盐酸氨基葡萄糖联合姜黄素对膝关节软骨细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和P53表达情况的影响，并进一步从基因水平分析盐酸氨基葡萄糖和盐酸氨基葡萄糖联合姜黄素对膝关节软骨细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax和P53表达水平的影响。方法40只大白兔随机分为空白对照组（A组），模型组（B组），盐酸氨基葡萄糖治疗组（C组），盐酸氨基葡萄糖联合姜黄素治疗组（D组），每组10只，B、C、D组采用改良Hulth法复制膝关节骨性关节炎动物模型，A组作为空白对照组。4周后模型建好开始，C组每天进行100mg/kg盐酸氨基葡萄糖灌胃、等量生理盐水进行关节内注射，D组除每天进行100mg/kg盐酸氨基葡萄糖灌胃外，每周进行5%姜黄素溶液9mg/kg膝关节内注射，A组和B组给予等量生理盐水进行关节内注射，四组均连续进行4周。之后将试验动物处死，取四组兔膝关节软骨标本，利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位末端平移法对四组兔膝关节软骨细胞凋亡情况进行检测，采用免疫组化的方法对四组兔膝关节软骨细胞中Bcl-2、Bax和P53蛋白表达情况进行检测，利用RT-PCR实验方法对四组兔膝关节软骨细胞中Bcl-2、Bax和P53基因表达水平情况进行分析。结果1.动物模型构建情况：40只大白兔均完成了整个实验过程，未出现中途死亡情况，30只OA动物模型均成功建立。2.四组兔膝关节软骨细胞凋亡情况：四组兔膝关节软骨细胞凋亡率间差异具有统计学意义（P<0.05），经LSD-t组间两两比较，B组、C组和D组AI值均高于A组（P<0.05），C组和D组AI值均低于B组（P<0.05），D组AI值低于C组（P<0.05）。3.四组兔膝关节软骨细胞凋亡相关蛋白表达情况：四组兔膝关节软骨细胞中Bcl-2蛋白表达阳性细胞率差异具有统计学意义（P<0.05），采用LSD-t检验，四组间两两比较差异均具有统计学意义（P<0.05），B组、C组和D组均低于A组，C组和D组均高于B组，D组高于C组；四组兔膝关节软骨细胞中Bax蛋白表达阳性细胞率差异具有统计学意义（P<0.05），经LSD-t组间两两比较，B组、C组、和D组均高于A组（P<0.05），C组和D组均低于B组（P<0.05），D组低于C组（P<0.05）；四组兔膝关节软骨细胞中P53蛋白表达阳性细胞率差异具有统计学意义（P<0.05），采用LSD-t检验对组与组之间进行比较，B组、C组和D组均高于A组（P<0.05），C组和D组均低于B组（P<0.05），D组低于C组（P<0.05）。4.四组兔膝关节软骨细胞凋亡相关基因表达情况：采用RT-PCR对Bcl-2、Bax和P53基因表达情况进行检测，四组兔膝关节软骨细胞中Bcl-2基因在各组中表达差异具有统计学意义（P<0.05），经LSD-t组间两两比较，B组、C组、D组表达水平均低于A组（P<0.05），C组和D组表达水平均高于B组，D组高于C组，差异均具有统计学意义（P<0.05）；四组兔膝关节软骨细胞中Bax在各组差异具有统计学意义（P<0.05），经LSD-t组间两两比较，B组、C组和D组表达水平均高于A组（P<0.05），C组和D组均低于B组（P<0.05），D组低于C组（P<0.05）；P53在四组兔膝关节软骨细胞中表达差异具有统计学意义（P<0.05），经LSD-t组间两两比较，B组、C组和D组均高于A组（P<0.05），C组和D组均低于B组（P<0.05），D组低于C组（P<0.05）。结论1.采用改良Hulth法可以成功复制大白兔膝关节骨性关节炎模型；2.大白兔膝骨关节炎模型关节软骨细胞发生凋亡，凋亡细胞发生率远高于未发生关节炎的对照组；3.大白兔膝骨关节炎模型关节软骨细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和P53表达发生改变，Bcl-2蛋白表达阳性率较对照组降低，Bax蛋白表达阳性率较对照组升高，P53表达阳性率较对照组升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）；4.利用RT-PCR技术，大白兔膝骨关节炎模型关节软骨细胞中Bcl-2基因表达较对照组降低，Bax基因表达较对照组升高，P53基因表达较对照组升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）；5.盐酸氨基葡萄糖可以有效升高大白兔膝骨关节炎模型关节软骨细胞中Bcl-2蛋白表达水平，降低Bax蛋白和P53蛋白表达水平，从而达到抑制关节软骨细胞凋亡的作用，联合姜黄素后作用效果要高于单独使用盐酸氨基葡萄糖；6.盐酸氨基葡萄糖能够增强大白兔膝骨关节炎模型关节软骨细胞中Bcl-2基因表达水平，减少Bax基因和P53基因表达水平，从而抑制关节软骨细胞的凋亡，联合姜黄素后作用效果增强，强于单独使用盐酸氨基葡萄糖作用效果。