研究背景和目的临床上因先天性畸形、外伤及肿瘤切除术等各种原因造成的大体积软组织缺损一直是整形修复外科面临的重大挑战之一。2011年有近5百万例的修复重建手术,78%的源于肿瘤切除术后的软组织缺损的修复与重建。全球范围内每年大约有130万乳腺癌新病例,乳癌切除后必将造成大范围的软组织缺损。治疗这种软组织缺损不仅仅是为了填补空缺,更重要的是要形成具有功能性、能长期维持稳定并与周围组织结合能够重建并完善组织的自然外观和美学功能。传统的乳房再造的手术方案多采用自体皮瓣和脂肪瓣转移修复。术后都不可避免地造成供区不可逆的畸形与疤痕。因此能够构建定形状、定体积、可供移植的软组织瓣成为了临床医师的“终极梦想”。1999年Patrick利用前脂肪细胞在聚乳酸乙醇酸材料上成功构建出脂肪组织,通过生物活性支架材料复合特异性种子细胞,首先实现了在体内外构建工程化脂肪组织的尝试。但直至近期的报道,成功构建的组织工程化脂肪组织,其体积都没有超过lml,并且在组织构成和组织稳定上都难以达到满意的结果。随着研究的深入,目前认为组织工程化脂肪组织的体积主要取决于：①构建物早期的快速血管化,这是限制组织工程技术最终构建物体积的关键因素；②可随构建物动态发展、可控吸收、良好生物相容性的生物材料；③符合构建物发生发展的生长因子梯度及微环境；④稳定的物理屏障以保障构建物体积和组织形态的稳定。针对这些关键因素,Hofer等人于2003年提出“组织工程室技术(Tissue Chamber Technique)"的概念,即采用生物惰性材料制作有一定硬度的壳状容器,而后将在体血管转移到其内部,为拟构建的组织提供血运基础、营养物质和生长所需空间,称为血管化组织工程室。这种创新型的构建模式思路为我们的组织工程研究大大拓宽了道路。随着研究的深入,Morrison及其团队运用组织工程室技术,在大动物体内引入带轴心血管的脂肪瓣成功构建出大体积(最大达56.5ml)带蒂脂肪瓣的实例,这无疑使组织工程室技术运用于解决大体积软组织缺损的修复成为一把“新式武器”,尽管目前还有诸多尚待解决的问题。初步研究认为：局限性的工程室能够富集组织新生的相关生长因子,同时硬性的工程室外壳为新生物提供较为坚固的物理支撑,一方面可以保障构建物的生长所需空间,另一方面,小室内发生改变的生物力学环境也与组织新生存在着某些必然联系。可以肯定的是,这种新型的构建模式能够很好解决工程化组织体积大小受限于早期构建物的血管化程度的问题,那么是否这样就可以得到超过lml体积并以脂肪组织为主要结构成分的构建物呢?围绕这几个科学问题,关于组织工程室的前期实验研究了利用组织工程室模型和预构技术,通过加强早期血管化,观察最终诱导新生物的组织结构,探讨通过促进血管化策略是否能构建出大体积的新生组织,而其结果显示在工程室内引入单纯血管蒂能够诱导出大于lml的以富血管化的纤维结缔组织为主的新生组织,加入脂肪组织特异性外源性种子细胞,成功构建出1.1ml的新生组织,组织结构主要是纤维结缔组织,可见新生血管,但未见到明显脂肪组织结构。而后通过对组织工程室内单纯成脂微环境和内环境的对比,揭示局部微环境对于构建大体积新生物的影响：在工程室内单纯添加成脂诱导环境,最终形成的新生组织以纤维结缔组织为主,未见明显血管及脂肪新生。最后利用0.6m1的带有轴心血管蒂的脂肪瓣成功诱导出3.0m1的成熟工程化脂肪瓣,这对于推动大体积成熟工程化脂肪组织的构建意义重大。在此基础上,为进一步探讨组织工程室模型的成脂诱导机制及其有关影响因素,本实验首先设计了两组不同的组织工程室模型(有孔模型,无孔模型),通过引入带有轴心血管的等体积(0.6ml)脂肪瓣,对诱导新生物的组织结构及室内相关细胞因子表达情况进行动态观察,探讨血管化与成脂化的相互关系,并通过细胞鉴定的方法探讨新生脂肪细胞来源,这对于如何构建大体积成熟工程化脂肪组织的意义重大,揭示小室内发生什么样的改变才能诱导产生大体积新生脂肪,为临床应用提供实验及理论基础。方法1、两种组织工程室模型诱导的大体积软组织构建物的组织学观察通过有孔与无孔组织工程室模型,比较不同小室内环境下对于新生成脂的影响,通过不同时间点观察新生组织的体积大小、组织形态等动态变化的过程,探讨构建大体积工程化软组织的最佳小室模型。2、组织工程室内组织新生的诱导及调控利用组织工程室模型,观察新生物不同时间点室内炎症反应的变化情况,各血管化细胞因子及成脂因子及趋化因子的表达情况,探讨内环境对于新生成脂的诱导及调节作用。3、关于种子细胞来源的思考及初步实验探讨将带有轴心血管蒂的脂肪瓣植入组织工程室内,不加入外源性种子细胞和生物支架,利用脂肪瓣内成熟的血管化和脂肪化条件,进行大体积脂肪组织的诱导,据脂肪新生出现时间,寻找鉴定新生脂肪细胞的来源及成脂的发生过程。4、统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示,使用统计软件SPSS13.0进行数据处理。两组之间比较采用配对t检验；不同时间点的差异采用协方差分析。结果1、利用组织工程室和带轴心血管的脂肪瓣能够在不添加任何外源性种子细胞,支架材料及生长因子的情况下诱导出大于1ml的以脂肪组织为主的新生组织,镜下可见明显脂肪组织小叶状结构。不同小室模型下组织结构稍有不同：有孔的组织工程室模型因其早期更充分的内环境交换及生长因子富集作用以及纤维条索长入的有利因素,更易形成体积较大,结构稳定的脂肪组织。2W后HE染色可发现有孔小室中存在粗大纤维条索结构由室外向室内长入的现象,这无疑改变了室内生物力学环境更有利于脂肪新生。2、通过连续时间点观察发现新生组织存在动态变化的重塑过程。早期(1W)可见“纤维蛋白原基质”的沉积以炎性反应为主要表现,并不伴有明显的血管长入。随后出现血管形成伴随着脂肪新生,稍晚期可见新生组织中脂肪细胞、血管和细胞外基质进行动态重塑,最终形成具有标志性脂肪小叶结构的成熟脂肪组织。不同时间点VEGF及SDF-1的表达水平2组存在显著差异。同时成脂因子PPAR-γ,炎症因子(IL-1/IL-6)及胶原表达(Collagen6)2组中均存在差异并随时间产生差异性变化,提示血管化与脂肪化密切相关以及在脂肪新生过程中存在着脂肪组织重塑现象。3、在近血管处发现CD34和围脂滴蛋白双阳性细胞,提示新生脂肪细胞来源是由具有成脂定向分化能力的干／组细胞的分化而来,这类细胞成为了脂肪新生的细胞学基础。而早期形成的以细胞外基质成分为主的胶冻状物质可以看作一种临时性的适应性支架,有利于成脂细胞的攀附、增殖和分化。讨论目前临床上修复大体积软组织缺损主要是自体脂肪移植和软组织瓣转移法,术后都不可避免地造成移植不成功或供区不可逆的畸形与疤痕。利用传统的组织工程三要素很难获得大体积成熟脂肪组织,关键在于诱导过程中不能满足血管化和脂肪化的协调发展,早期血供的延迟成为构建大体积工程化脂肪组织的瓶颈。2003年“组织工程室”概念的提出为解决这个问题提供了新的视角。组织工程室可以在早期通过组织创伤释放的生长因子作用下迅速促进新生血管网的成熟；并且在室内局部富集生长因子和细胞因子,为室内内容物的生长提供稳定的内环境；具有一定硬度的工程室能够为室内容物的生长提供稳定的物理支撑,改变新生组织所处的力学环境,为大体积脂肪组织的诱导新生提供了可行的思路。但是鉴于脂肪组织结构的特殊性,组织工程室模型中真正能影响大体积成熟脂肪组织构建的决定因素至今尚不清楚,这样影响了大体积工程化脂肪组织的构建策略。脂肪组织的增长需要丰富的血管网络,局部成脂微环境的同时存在,这是间充质干细胞进行分化的必要条件,只有是血管化和成脂化相互协调发展,才能最终保证大体积成熟脂肪组织的构建成功。我们前期的实验证实,仅提供充足的血供,微环境的缺乏不能自主分化成脂,导致难以对工程化组织的构建实现定向控制,不能构建出大体积的新生脂肪组织。单纯在室内加入脂肪组织块作为成脂微环境,最终因为缺少血液的供应,新生组织依然为纤维结缔组织并缺少血管长入。只有同时保证充分血供,成脂环境下种子细胞才有可能分化增殖形成脂肪。通过现阶段的实验,单纯地将一个带轴心血管的脂肪瓣置入组织工程室中即可获得大体积的带蒂脂肪组织,这无疑是一项鼓舞人心的重要发现。深入探讨室内成脂机制,仍围绕组织工程三要素展开：1.怎样的内环境最有利于成脂?2.何种支架材料与脂肪的生长最为合适匹配?3.新生脂肪细胞从哪里来?通过对室内内环境的连续观察,我们发现工程室内早期的组织渗出液中含有大量的生长因子和炎性介质,这类组织渗出液呈胶冻样状态,电镜下观察具有3-D结构并能够支持细胞的攀附生长及分化,甚至可以观察到纤维细胞样的细胞在“自组装支架”上的伸展,这极有可能为种子细胞提供了生长所需的物理支撑。同时我们在血管周围发现了同时表达CD34和围脂滴蛋白的小脂肪细胞,提示这些细胞具有定向成脂分化能力,其可能来源于血源性的间充质干细胞,迁移并定植在血管周参与脂肪新生。我们通过在工程室内植入带有轴心血管蒂的脂肪瓣,4周后即能得到5m1的成熟工程化脂肪组织,并且新生组织形状同工程小室形状相似。这是继澳大利亚实验团队构建出大体积软组织瓣后首次构建出单纯脂肪组织瓣的成功尝试,对于将来组织工程室技术诱导大体积软组织再生应用于临床提供了实验基础。尽管组织工程室技术的构建方案尚不完全成熟,构建物表面包膜限制了体积的进一步增长,但其结构正常,远期稳定性值得肯定,因此这种大体积工程化脂肪组织构建策略对于临床上各种部位、不同形式的大体积软组织缺损的修复不失为一种安全、稳定、有效的新途径。结论1、组织工程室模型可以在不添加任何种子细胞,外源性支架材料和细胞因子的条件下自发成脂,能够诱导大体积脂肪组织的新生,有孔模型因其更优化内环境条件在促成脂方面更具优势。2、小室内发生改变的力学环境,早期炎症反应可能是新生成脂的启动因素,各类细胞因子的富集致使大体积脂肪再生成为可能。3、新生的脂肪细胞由CD34和围脂滴蛋白双阳性的细胞分化而来,这部分细胞具有成脂定向分化能力,可能来源于血源性或定植于原有脂肪组织中的间充质干细胞。