目的脑出血是神经系统常见病、多发病,其致残率和死亡率均很高,严重影响人类的健康和患者的生存质量。近年来,炎症反应在脑出血后继发性损伤中的作用越来越受到重视,并认为它可能导致了脑出血后的细胞凋亡过程。目前脑出血后炎症发生机制目前仍不十分清楚,其产生炎症反应的始动环节尚不明确。TLRs是一个新发现的有高度保守序列而古老的天然免疫受体家族。TLR2作为膜受体“门户”蛋白能够识别生物源性和非生物源性刺激,然后将信号传递给核转录因子NF-κB,启动和放大炎症反应,导致多种炎症因子的瀑布式释放,产生损伤效应。本研究利用立体定向技术向大鼠尾状核内注入50μL自体股动脉血建立脑出血模型,用TUNEL染色观察神经细胞凋亡,用免疫组化法检测脑出血后的血肿周围脑组织TLR2、NF-κB/p65和caspase-3的表达动态变化,初步探讨脑出血后三者的动态变化与细胞凋亡的关系,从而探讨TLR2信号通路在脑出血后继发损伤(主要指凋亡)中的作用。材料与方法一、材料1、动物分组选择健康雄性SD大鼠45只,体重250-300g,随机分成生理盐水对照组、脑出血实验组,分别按6h、1d、3d、7d分为4个亚组,每个亚组n=5；1个正常对照组,n=5。2、主要仪器动物头颅立体定位仪、电子分析天平、图像分析仪、紫外分光光度仪。3、主要试剂TLR2兔抗鼠多克隆抗体、NF-KB/p65兔抗鼠多克隆抗、Caspase-3兔抗鼠多克隆抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒。4、大鼠脑出血模型制作用微量注射器抽取70uL大鼠自体股动脉血。立即将大鼠俯卧位于脑立体定位仪上,于前囟前0.2mm,中线右旁3.0mm,进针约6mm(大鼠尾状核处),将大鼠自体股动脉血50uL缓慢推注入脑。生理盐水对照组注入50uL生理盐水。正常对照组不予任何处置。5、标本制作取各组大鼠于术后相应时间点麻醉开胸,迅速暴露心脏,4%多聚甲醛灌注固定,取脑,样本置于4%多聚甲醛外固定24小时,酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋。连续冠状切片,片厚5um,进行切片HE染色和免疫组化染色。二、检测指标1、TUNEL阳性细胞检测切片滴加脱氧核糖核酸转移酶(TDT)和地高辛标记的dUTP反应液,37℃孵育120min；滴加生物素化抗地高辛抗体,37℃孵育30min,各步骤用0.01MTBS(pH 7.5)洗涤3min×3次；DAB显色,苏木素复染,脱水、透明、封片。显微图像分析系统采集图像,分析阳性细胞积分光密度。2、SABC免疫组化检测SABC法进行TLR2蛋白、NF-κB/p65蛋白、Caspase-3蛋白表达阳性细胞测定。切片滴加50uL一抗工作液(兔抗鼠多克隆TLR2抗体(1：200)、兔抗鼠多克隆NF-κB/p65抗体(1：300)、兔抗鼠多克隆Caspase-3抗体(1：150)),4℃过夜；然后滴加物素化山羊抗兔IgG,室温20min；滴加SABC,室温20min,各步骤用PBS洗3min×3次；DAB显色剂,木素轻度复染,脱水透明,封片。显微图像分析系统采集图像,分析阳性细胞积分光密度。三、统计分析所有数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS16.0及Excel统计软件进行数据处理,组间比较用单因素方差分析(ANOVA),在单因素方差分析有意义的基础上再进行组间两两比较,两变量之间相关关系行spearman相关分析,p<0.05为差异显著。结果1、脑出血后细胞凋亡的动态变化TUNEL染色阳性细胞在脑出血后6h出现,1d凋亡细胞数明显增多,3d达到高峰,7d后逐渐减少,但是与对照组相比仍有显著差异(p<0.05)。凋亡细胞数主要在血肿周围和同侧大脑皮层。脑出血后3d出现一些典型凋亡细胞,如新月形、马蹄形和由核碎片聚集的凋亡小体。凋亡细胞大部分是神经元细胞。2、脑出血后caspase-3蛋白表达脑出血后6h在血肿周围和同侧大脑皮层有caspase-3弱阳性表达,阳性部位主要为胞浆。1d后出现大量阳性反应神经元。脑出血后3d达高峰,着色最深,呈棕褐色,并出现核阳性着色,说明caspase-3裂解后有核转移。7d后数量减少,但积分光密度较对照组仍有显著差异(P<0.05)。3、脑出血后NF-KB/p65表达脑出血后血肿周围NF-KB/p65阳性细胞于术后6h开始增多,1d其表达继续上升,3d达高峰,此后NF-KB/p65表达开始下降,持续到7d仍高于对照组(p<0.05)。其表达以胶质细胞为主,也有部分神经元细胞,阳性表达为胞核黄褐色,苏木素不能复染。血肿对侧也有少量NF-KB/p65表达。生理盐水对照组仅有极少量阳性细胞。4、脑组织TLR2蛋白表达脑出血组出血肿周围和同侧大脑皮层有TLR2表达均高于对照组,6h开始升高,3d达高峰,之后表达强度缓慢下降,7天后表达与对照组相比仍有显著差异(p<0.05)。讨论在本实验中采用向大鼠右侧尾状核内注射自体股动脉血制作脑出血模型,免疫组化法对TLR2进行检测,发现出血后的大鼠脑组织中TLR2蛋白有动态表达。近年来,许多实验研究都证实,细胞凋亡机制参与了脑出血后继发性损伤。在本实验中应用相邻切片分别进行Caspase-3免疫组化和TUNEL染色,两者阳性细胞范围及时间变化基本一致。提示Caspase-3在脑出血后神经细胞凋亡中起重要调控作用。NF-κB信号通路是TLR2胞内信号转导通路中最重要的下游通路,参与炎症反应和细胞凋亡等重要的病理生理过程。本实验发现,TLR2表达与NF-κB表达量及核阳性率的升高呈正相关,且与炎症细胞浸润高峰也一致,这表明TLR2表达的增多伴有神经细胞内NF-κB的激活,即NF-κB的核移位,但是这并不能从本质上说明TLR2激活了NF-κB,只能说TLR2参与了脑出血后大鼠脑内的炎症反应。但已有大量实验证明TLR2信号途径主要集中激活NF-κB,启动和放大炎症反应,导致多种炎症因子的瀑布式释放,产生损伤效应。大量文献也证实了脑出血后血肿周围存在上述炎症反应,并认为它可能导致了脑出血后的细胞凋亡过程。大鼠脑出血后炎症细胞浸润时间与细胞凋亡时间均呈正相关。由此推断TLR2介导的NF-κB信号途径可能参与脑出血后的炎症反应,并加重神经元损伤和凋亡结论1、脑出血后脑组织TLR2、NF-KB/p65、caspase-3的表达增高,且与TUNEL阳性细胞的表达变化趋势相一致。2、TLR2介导的NF-κB信号途径可能参与脑出血后的炎症反应,并可能通过caspase-3介导神经元损伤和凋亡。