缺氧对ANP分泌的影响及其机制探讨心脏是推动血液流动的动力器官,直到1981年De Bold等发现心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)之后,确定心脏不仅是个血泵,同时也是内分泌器官,可以生成和分泌ANP。ANP是钠尿肽家族(family of natriuretic peptides, NPs)的第一个成员,之后相继发现了NPs的其他成员,即脑钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)、C-型钠尿肽(c-type natriuretic peptide, CNP)和D-型钠尿肽(dendroaspis natriuretic peptide, DNP)。ANP是由心房肌细胞合成和释放,并与心脏、血管、消化道、中枢神经系统、淋巴组织、生殖器官及肾脏组织等存在的钠尿肽受体(natriuretic peptide receptors, NPRs)结合,从而发挥一系列生物学效应。ANP的主要生物学作用是排钠利尿,参与水盐平衡和血压调节等,对维持人体内环境稳态发挥重要作用。而近年来,越来越多的研究逐渐揭示了ANP的其他生物学功能,例如抵制心肌肥厚和抗纤维化；改善心肌结构、抵抗心力衰竭；抵制氧化应激反应和减少自由基生成等,对于ANP的心肌保护作用有了新的认识。ANP的分泌受物理因素、体液因素和神经因素等影响。如增加血容量、心房膨胀或心房压力升高、缺血缺氧以及内皮素、血管紧张素Ⅱ、糖皮质激素等均能影响ANP的释放。此外,肾上腺素能、胆碱能以及肽能受体对ANP分泌也有调节作用。然而心房肌细胞的牵张(stretch)刺激被认为是调节ANP分泌的最关键因素。缺氧缺血是调节ANP分泌的另外一种重要因素。离体情况下,在体外培养的心房肌细胞和离体心脏灌流模型中的实验均证实缺氧能明显促进ANP分泌,同时在整体实验中,例如肺动脉高压症、心力衰竭及高海拔环境等同样能使外周血液中的ANP浓度明显增高。Skvorak等报道,缺血诱导ANP分泌增加归根于内皮素(endothelin, ET)的增加,且缺血缺氧时分泌增加的ANP被视为是调节机体稳态的反应机制,但目前缺氧调节ANP分泌的机制尚未弄清。缺氧是一种组织得不到充足的氧或不能充分利用氧时,组织的代谢、功能等发生异常变化的病理过程,是许多疾病状态如心肌梗死、脑卒中等的病理生理学改变的主要原因。缺氧时引发一系列信号传递过程,其中包括缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)的激活。HIF-1是在缺氧诱导的肝癌细胞细胞核抽提物中发现的广泛存在于哺乳动物体内的DNA结合蛋白,是目前唯一一个具有高度特异性、在缺氧状态下发挥活性及专一调节氧稳态的关键性核转录因子,其生物学效应由亚基HIF-1α实现。HIF-1α是一个重要的中介物质,通过它进而对一系列的低氧反应基因(hypoxia responsive genes, HRG)进行转录调节,从而产生一系列对缺氧的适应性反应。其中HIF-1直接与心肌细胞中内皮素-1(ET-1)基因启动子结合位点结合来实现对ET-1表达的调控。研究证实,慢性反复缺氧后HIF-1α与促进ET-1基因表达有关,且ET系统的活性受HIF-1活性的调节。ET是血管内皮细胞合成和分泌的具有收缩血管功能的活性多肽,其中ET-1是ET家族中含量最多、生物活性最强的一员,是迄今为止发现的最强有力的缩血管因子。而ET-1也是强烈促进ANP分泌的重要因素,故推测HIF-1或者其靶基因ET-1可能参与调节缺氧诱导ANP的分泌。缺氧时HIF-1的表达与活性的调节主要受细胞氧浓度的影响,这是它的一个特征。但是其他信号通路也参与调节HIF-1α表达,其中重要的一条通路是就是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated-protein-kinase, MAPK)途径。MAPK可促进HIF-1α磷酸化,参与HIF-1α的表达量和活性的调节。MAPK通路包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-teminal kinase, JNK)也称之为应激活化蛋白激酶1(stress activated protein kinase, SAPK1)及P38蛋白激酶(P38MAP kinase).最近研究发现,心肌中的ANP是由HIF-1诱导生成的。HIF-1的大量表达可明显增强ANP启动子的活性。其他研究也发现,缺血缺氧时HIF-1可能通过激活心肌ANP表达而发挥对心肌的保护作用。但目前缺氧时HIF-1与ANP的分泌或调节HIF-1活性的MAPK信号通路与ANP分泌的相互关系尚不完全明确。因此,本实验利用家兔离体心房灌流装置和以氮气制备急性缺氧模型,采用内皮素A型受体(ET A receptor,ETA)阻断剂和内皮素B型受体(ET B receptor, ETB)阻断剂BQ123和BQ788以及JNK抑制剂SP600125等,观察急性缺氧对家兔离体心房ANP分泌的影响,探讨缺氧时ANP分泌变化与内源性ET-1的相互关系,揭示MAPK的JNK信号通路对缺氧诱导ANP分泌中的重要作用,为研究缺氧时ANP分泌机制及其功能提供必要的实验依据。本实验结果如下：1.在家兔离体心房灌流模型中,急性缺氧明显促进心房ANP的分泌(P<0.001vs control),同时强烈抑制心房搏动压(P<0.001vs control)和心房搏出量(P<0.001vs control)。2.缺氧能增加离体心房ET-1的释放(P<0.05vs control);同时预处理两种ET-1受体阻断剂(BQ123+BQ788)后再制备缺氧时发现,BQ123+BQ788明显抑制缺氧诱导心房ANP的分泌(P<0.001vs hypoxia),但并不能完全阻断其效应,此时心房搏动压和心房搏出量均显著下降(P<0.001vs control)。3. MAPK信号转导通路的JNK途径抑制剂SP600125可明显减缓缺氧促进ANP分泌的效应(P<0.001vs hypoxia)和缺氧对ET-1的分泌(P<0.05vs hypoxia); SP600125对缺氧诱导ANP分泌作用明显强于BQ123+BQ788的作用(P<0.001vs BQ123+BQ788),但依然没有全部阻断缺氧对ANP分泌的增加,此时心房搏动压和心房搏出量也均显著下降(P<0.001vs control).4. SP600125+BQ123+BQ788一同处理依然明显抑制缺氧诱导ANP的分泌(P<0.001vs hypoxia),且其作用与单独处理SP600125时的效应无显著差异,但仍强于BQ123+BQ788对缺氧诱导ANP分泌的抑制作用(P<0.001vs BQ123+BQ788)。以上结果提示：1.急性缺氧明显增加离体心房ANP的分泌；2.HIF-1的靶基因ET-1参与调节缺氧诱导ANP分泌的过程；3.调节HIF-1活性的JNK信号途径在缺氧诱导ANP分泌过程中起重要作用。心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)是1981年De Bold等发现的由心房肌细胞合成和分泌的肽类激素。最早发现的ANP生物学作用是排钠利尿,参与水盐平衡和血压调节等。但是随着对ANP的深入研究发现,ANP与许多缺血缺氧相关性疾病如急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)、充血性心力衰竭(congestive cardiac failure, CHF)、肺动脉高血压引起的肺心病(pulmonary heart disease, PHD)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)等关系密切。后经证实,ANP在此类疾病发生和发展过程中发挥抵制心肌肥厚和抗纤维化；抵抗心力衰竭、改善心肌结构；抑制氧化应激反应,减少自由基生成以及抵制心肌缺血/再灌注损伤等重要的生物学效应。心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury, MIRI)是指缺血的心肌经恢复血液灌注后不但不能使其功能和结构得到恢复,反而加重其功能障碍和结构的损伤。由于在缺血性心脏病治疗(再灌注)过程中易发生MIRI,使得缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)的治疗难度加大,且目前对其还没有有效的防治手段。近年来,很多研究证实,ANP对缺血/再灌注损伤具有较好的保护作用。ANP不仅可以增加动物模型中再灌注心脏的心输出量、减少缺血/再灌注心脏的心梗面积,在急性心肌梗死患者体内注射ANP能抵制缺血/再灌注带来的心脏损伤,但是ANP发挥心肌保护的具体作用机制还不清楚。研究认为,线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)的开放是导致缺血/再灌注损伤的关键性因素。Halestrap等报道,mPTP的开放发生在再灌注期,而不是缺血期,并且防止mPTP的开放是减轻再灌注损伤的有效手段,抑制mPTP的开放是许多心脏保护类物质抗缺血/再灌注损伤的共同机制。正常状态下,mPTP保持关闭状态抵制氢离子等进入线粒体内,使线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)维持内负外正。当nPTP开放时,立即引起ΔΨm的去极化,使ΔΨm衰减。糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase3β, GSK-3β)在心肌保护中也起非常重要的作用。静息时GSK-3β保持激活状态,而用药物抑制GSK-3β的活性能减轻心肌缺血/再灌注损伤。已证实的GSK-3β心肌保护作用机制主要是通过GSK-3β Ser9位点的磷酸化抑制其活性,从而阻止mPTP的开放来保护再灌注损伤的心肌。ANP可以催化颗粒状鸟苷酸环化酶(particulate guanylyl cyclase, pGC),从而使细胞内环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)生成增多。相关研究证实,ANP对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用与ANP诱导cGMP的生成有关。蛋白激酶G (protein kinase G, PKG)是cGMP的重要下游信号,而cGMP/PKG信号途径通过防止mPTP的开放来实现对缺血/再灌注心脏的保护作用。非特异性磷酸二酯酶抑制剂异丁基甲基黄嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine, IBMX)通过cGMP/PKG途径使GSK-3β失活,从而抑制mPTP的开放。因此本研究推测,ANP的心肌保护作用可能通过cGMP/PKG信号途径而抑制GSK-3p的活性,进而防止mPTP的开放来实现。除此之外,GSK-3β活性受磷脂酰肌醇三羟基激酶(Phosphoinositide3-kinase, PI3K)／蛋白激酶B (Akt)信号途径的调节。PI3K/Akt信号通路在缺血预处理引起的心脏保护中发挥重要作用,并且该信号通路通过抑制：mPTP的开放来抵制缺血／再灌注损伤。最近报道,ANP能通过激活Akt来抑制细胞编程性死亡(apoptosis)。因此,本实验利用langendorff装置和H9c2大鼠心肌细胞株,观察ANP对大鼠缺血／再灌注损伤的保护作用,并探讨ANP的心脏保护作用与mPTP开放及GSK-3p之间的相互关系,进一步观察PKG/cGMP和PI3K/Akt信号途径在ANP诱导心肌保护中的作用。本实验结果如下：1.固定于Langendorff装置的心脏经过30min缺血期和120min的再灌注期,再灌注开始前5min给与ANP并持续35min。结果显示,与对照组相比ANP(0.03μmol/L)使大鼠心脏心肌梗死面积明显减小(P<0.001vs control),表明ANP.能够保护再灌注心脏。对照组和实验组缺血之前左心室发展压(left ventricular-developed pressure, LVDP)和左室舒张末期压力(end-diastolic pressure, EDP)无明显差异(P>0.05)。2.采用四甲基罗丹明乙酯(tetramethyrhodamine ester, TMRE)荧光染料和激光共聚焦显微镜成像技术,测定线粒体△Ψm的变化,以判断mPTP的开放程度。对照组用600μM H2O2处理20min后,TMRE荧光强度明显减小,说明氧化应激引起mPTP的开放。与此相比,0.01、0.1、1.0、10.0nmol/L的ANP明显抑制氧化应激诱导的TMRE荧光强度的减少(P<0.01vs control),其中1.6nmol/LANP的效应为最强,提示ANP能够抑制mPTP的开放。3.利用Western blotting观察GSK-3β Ser9位点磷酸化的情况,以探讨GSK-3β在ANP抑制mPTP开放中的作用。用ANP处理H9c2细胞20min,0.01、0.1、1.0、10.0、100.0nmol/L的ANP明显增加GSK-3β的磷酸化(P<0.01vs control),表明ANP能够抑制GSK-3β的活性。用激活型GSK-3β质粒(GSK-3β-S9A)转染细胞,使GSK-3β处于持续激活状态后发现,ANP(1.0nmol/L)未能防止TMRE荧光强度的减少(P<0.05vs ANP)。由于抑制GSK-3β的活性可阻止mPTP的开放,此结果进一步证明了ANP通过抑制GSK-3β活性而阻止mPTP的开放。4.为了探讨ANP是否通过PKG使GSK-3β失活,进而抑制mPTP的开放,用PKG阻断剂KT5823(1.0μmol/L)处理细胞后观察了ANP(0.1和1.0nmol/L)对mPTP开放和GSK-3β活性的影响。结果显示,KT5823明显衰减ANP抑制mPTP开放和GSK-3β磷酸化的作用(P<0.01vs ANP)。进一步的实验显示,cGMP类似物8-Br-cGMP本身并不能明显增强GSK-3β磷酸化,’而必须和PKG Iα共同作用时才表现出增加GSK-3β磷酸化的作用。同样,8-Br-cGMP与PKG Iα的直接相互作用使纯化GSK-3β的磷酸化明显增加。以上结果表明,ANP通过cGMP/PKG使GSK-3β失活,进而防止mPTP的开放。5.用PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002,探讨了PI3K/Akt是否介导ANP对心肌的保护作用。LY294002(1.0μmol/l)能明显减弱ANP(0.1.1.0nmol/L)对mPTP开放和GSK-3β的抑制作用(P<0.01vs ANP),提示P13K/Akt参与ANP对GSK-3β和mPTP的抑制作用。结论：1、ANP显著减少缺血/再灌注心脏的心肌梗死面积；2、ANP通过PKG和P13K/Akt途径使GSK-3β失活,并抑制(?)mPTP的开放,从而对心肌发挥保护作用。