背景及目的各种原因所致的肝衰竭严重威胁着人类健康，原位肝移植由于费用昂贵、供体短缺限制其在临床的应用。生物人工肝支持系统(Bioartificial liversupport system，BALSS)借助体外装置暂时替代肝脏功能，直至自体肝脏功能恢复或进行肝移植，是目前肝衰竭治疗研究的热点之一。肝细胞是生物人工肝支持系统的核心部分，从生物工程学角度讲，理想的用于生物人工肝的肝细胞要人源性、表型正常，容易获得和培养，能在体外迅速生长增殖至高密度，保持良好的分化状态，具有成熟肝细胞的所有生物代谢功能。但是人原代肝细胞存在体外培养条件苛刻、存活时间有限、增殖传代困难及来源短缺等问题。端粒(telomere)是位于真核细胞染色体末端，由富含鸟嘌呤核苷酸的DNA重复序列与端粒结合蛋白构成的蛋白-DNA复合体，对维持基因组完整性和功能稳定性有重要作用，细胞分裂过程中发生的端粒末端结构的变化与正常细胞衰老和永生化密切相关。端粒酶介导的端粒延长是细胞中端粒缩短的主要补偿机制，对正常细胞延长分裂代数起着重要作用。人端粒酶逆转录酶(Human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT)是端粒酶活性的主要决定因素。本研究克隆人hTERT的编码区全序列，选用绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)作为目的基因表达标志物，构建hTERT真核表达质粒，并在细胞水平对所构建质粒的表达效能进行鉴定，为hTERT稳定转染细胞提供简单、快速的检测方法；同时探讨体外分离小块肝组织培养正常成人肝细胞的方法，为人肝脏细胞的永生化提供细胞材料；并且初步评价人肝肿瘤细胞系生物人工肝治疗重型肝炎肝衰竭患者的临床疗效和安全性。方法首先采用PCR方法扩增hTERT基因和GFP基因，再利用基因重组技术构建真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT，筛选阳性克隆进行双酶切、聚合酶链反应和序列测定。将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞，在荧光显微镜下观察GFP的表达情况，然后收集转染后的细胞，提取核蛋白，用免疫印迹方法验证hTERT的表达强弱。收集外科手术切除的成人肝组织块，采用胰蛋白酶和胶原酶分离人肝细胞，并用普通培养和鼠尾胶原进行培养，观察分离培养效果。第二部分选择2006年6月至2007年4月在解放军302医院住院的重型肝炎肝衰竭的患者，采用2∶1随机、对照分组，其中12例接受血浆透析滤过(plasma diafiltration，PDF)和人肝肿瘤细胞系生物人工肝治疗，5例作为对照组仅接受PDF治疗，两组的内科治疗基本相同。治疗前后，以及随访过程中检测生命体征、肝功能、凝血功能、甲胎蛋白等。采用CHISS 2005统计软件进行统计学分析。结果1．重组质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的双酶切、聚合酶链反应鉴定和测序结果均与预期完全相符。2．转染HepG2细胞，荧光显微镜下观察hTERT和GFP的融合蛋白在细胞核内表达增强。免疫印迹结果显示，HepG2细胞转染pEGFP-C1-hTERT和VR1012-GFP-hTERT后，其hTERT表达水平较未转染组明显增强。3．用胶原酶消化法所获的的人原代肝细胞活性约80％，贴壁能力和生长状态相对较好，分离1.5×1.5×1.5cm大小的肝组织块可获得约(2-2.5)×10~7个肝细胞。4．人肝肿瘤细胞系生物人工肝治疗组的84天生存率高于对照组(83％vs 40％，P＜0.01)，两组的生存时间分别为84.58±1.56天vs 54.60±4.18天(P＞0.05)。COX比例风险模型分析可知，生物人工肝治疗是减少相对危险度延长生存时间的主要因素。生物人工肝治疗过程中，胆红素水平进行性下降。AST和AFP在治疗过程中一过性升高，随访84天未发现肿瘤发生的证据。结论1．成功构建了重组真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT，为hTERT转染细胞提供简洁、快速、实时的检测方法。2．用胶原酶分离成人原代肝细胞的方法具有操作简单、所获得的肝细胞数量较多、活性较高、节省胶原酶用量的优点，为肝细胞永生化提供细胞材料。3．人肝肿瘤细胞系生物人工肝总体性能良好，能促进患者体力恢复，降低胆红素水平，提高近期生存率，同时近期安全性良好。