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目的:P450单加氧酶分布在整个自然界中,各种生物体的生命活动都有其参与。在人体内P450酶主要存在于肝脏,与药物、酒精等外来物质的代谢有关,同时也代谢合成甾体、脂肪酸、前列腺素等生理化合物。在化学有机合成方面P450酶是有发展潜力的生物催化剂。CYP119是一种耐酸耐热的P450酶,其基因序列和晶体结构已被确认,但到目前为止该酶的内源性底物还未被发现。目前已有研究证实CYP119有催化月桂酸羟基化反应的作用,也有研究表明野生型CYP119酶可在过氧化氢存在下催化非天然底物苯乙烯发生环氧化反应。定向进化为目前改造酶结构,提高酶活性的常用方法。本实验通过易错PCR的方法构建CYP119酶突变文库,将突变体T213G/T214V,T214V,T213G表达纯化后用于催化苯乙烯环氧化反应,获得三种突变体在催化苯乙烯环氧化反应时的动力学性质、转化率和对映选择性特征。方法:将 Mn2+浓度分别为 0mmol/L,0.05mmol/L,0.1mmol/L,0.2mmol/L,0.4 mmol/L的5组易错PCR产物经胶回收纯化后与PMD18-T质粒载体相连接,转化DH5α感受态细胞,筛选阳性菌若干,测序,通过测序结果统计突变的碱基数,得出相应的突变频率以及有义突变的序列,并通过突变位点的分布分析易错PCR构建突变文库的最优条件。将易错PCR反应后经胶回收纯化的产物构建于PET30α载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,进行表达文库的构建。将突变体T213G、T213G/T214V、T214V突变酶进行表达纯化,用于催化苯乙烯及其衍生物环氧化反应,以高效液相色谱分析其动力学性质、转化率,以GC-MS联合手性柱检测,获得三种酶的对映选择性。结果:dATP 0.2 mmol/L,dGTP 0.2 mmol/L,dTTP 0.8 mmol/L,dCTP0.8mmol/L,Mn2+ 0.2 mmol/L为最佳的构库条件,平均碱基突变频率为1.4725%,有义突变频率为30%。通过测序结果得知,得到S40A,S221T,Y16C,I208T,Y16C,I208T,R279G,E296A,R328G,T214V,T213G,T214V/T2134G等有义突变体,这些突变可能对酶的性质有一定影响。经HPLC及GC-MS得到的数据分析得知T214V、T213G、T213G/T214V三种突变体均能保持较好的热稳定性,且其活性在高温下优于常温,但温度升高对映选择性降低。T213G、T214V突变体在35℃和70℃的Vm、kcat和对映选择性均优于野生型酶。T213G/T214V突变体在常温和高温下其与底物的亲和力和催化活性均低于野生型酶,但对映选择性优于野生型酶。这些结果表明T213、T214位点对酶的催化活性及对映选择性非常重要,T214V、T213G均使酶催化活性增加,但当两个位点同时突变后,反应性均降低,表明213和214位点的两个苏氨酸必须保留其中之一,才能保证酶的活性。结论:利用易错PCR的方法构建CYP119突变文库,其中Mn2+的浓度为0.2 mmol/L为最佳构库条件,获得突变体T214V,T213G,T213G/T214V,其中T213G酶催化活性显著高于野生型和T214V,而T213G/T214V催化活性较低,但对苯乙烯的对映选择性高于野生型酶。