论文部分内容阅读
人类基因组计划的完成使我们对于基因有了进一步的认识,我们确定了基因组中的基因编码序列,但是对于其功能却知之甚少。因此生命科学的发展的重点也转向了功能基因组学,基因的功能研究也因此成为研究热点。通过研究筛选发现了一些对免疫细胞有调控作用的功能未知的新基因,LYG1就是其中之一。LYG1定位于chr2q11.2,在各种属之间同源性较高,为保守基因,编码一个194个氨基酸的蛋白质,编码产物分子量21k Da,等电点(p I)8.168。应用Signal P分析其N端的19个氨基酸是典型的信号肽,且没有跨膜区域,推测LYG1蛋白是一个分泌型蛋白。LYG1在人体包括免疫系统在内的多种组织中均有表达,在免疫系统中表达稍高,可能参与炎症的发生与发展,在抗病毒、抗胞内病毒感染、抗肿瘤方面有着重要的应用价值。目的:建立小鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎模型,体外培养炎症相关细胞,研究LYG1在炎症反应中的作用。方法:1.体内实验动物模型建立及分组:BALB/C小鼠分为菌组(Kp)组20只、菌+蛋白组(LYG1+Kp)20只、正常组(Normal)10只。菌+蛋白组(LYG1+Kp)小鼠尾静脉注射100μl浓度为1 ng/μl的LYG1蛋白,菌组(Kp)小鼠和正常组小鼠尾静脉注射100μl的生理盐水,1h后,注射20μl的生理盐水到正常组小鼠气管内,菌+蛋白组(LYG1+Kp)和菌组(Kp)小鼠气管内注射20μl浓度为105cfu/m L的肺克菌。标本检测:肺炎克雷伯杆菌肺炎小鼠模型建立后的3h,6h,12h,24h四个时间点,取小鼠肺组织与外周血,使用HE染色进行病理学观察,测定髓过氧化物酶(MPO)与诱导型一氧化氮合酶(i NOS)的活性,免疫组化法、RT-PCR方法及蛋白免疫印迹法检测炎性因子的表达。2.体外实验细胞分组和处理:常规培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。实验分为PBS对照组、TNF-α阳性对照组(10ng/m L)、TNF-α(10ng/m L)+LYG1(10ng/m L)组、TNF-α(10ng/m L)+LYG1(100ng/m L)组和LYG1(100ng/m L)组。检测方法:CCK-8法检测LYG1蛋白对HUVECs细胞增殖的影响;实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹法检测LYG1蛋白对HUVECs细胞分泌炎性因子(IL-6、CXCL-2、MCP-1)及粘附分子水平的影响。结果:1.体内实验结果(1)小鼠肺组织HE染色发现LYG1蛋白能减轻小鼠急性肺炎所造成的肺损伤;(2)肺组织免疫组化显示LYG1能抑制趋化因子GRO的表达;(3)肺组织匀浆MPO和血清i NOS活性检测结果菌组+蛋白组的二者活性低于菌组,提示LYG1蛋白可以减弱小鼠肺炎模型中肺组织中性粒细胞的浸润,减轻炎症损伤;(4)肺组织炎性因子m RNA的PCR检测发现菌+蛋白组IL-1β、IL-6、TNF-α的表达均明显低于菌组,显示LYG1蛋白能够降低肺组织细胞因子的m RNA表达水平,减弱肺部炎症造成的肺损伤;(5)肺组织蛋白免疫印迹法结果菌+蛋白组与菌组相比,NF-κB的表达水平有所降低,提示LYG1蛋白能降低炎症状态下NF-κB的表达水平,LYG1蛋白对炎症的缓解可能是通过NF-κB通路实现的。3.体外实验结果(1)CCK-8法检测显示LYG1蛋白对经TNF-α诱导的HUVECs细胞增殖起到抑制作用,且抑制作用并没有随着蛋白浓度的增加而增强。(2)实时荧光定量PCR检测HUVECs细胞炎性因子m RNA水平发现,经过TNF-α刺激后,各组细胞的IL-6、MCP-1与CXCL2因子的m RNA水平的表达量均有所提高,加入LYG1蛋白,三种因子的表达量有所下降,LYG1蛋白对细胞的炎性因子分泌有一定的抑制作用。低浓度蛋白组比高浓度蛋白组对内皮细胞分泌炎性因子的抑制作用更强。(3)蛋白免疫印迹法检测HUVECs细胞VCAM-1蛋白表达发现TNF+LYG1组与TNF组相比,VCAM-1表达量有所下降,结果提示LYG1蛋白能够抑制粘附分子VCAM-1的表达,可能有抑制白细胞黏附等作用。结论:1.建立小鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎模型,通过检测多种炎性及相关因子的表达或活性可知LYG1蛋白在急性肺部炎症中起到了抑制作用。2.通过检测LYG1蛋白对于HUVECs细胞增殖和各种炎性因子的表达情况,可知LYG1蛋白能够抑制HUVECs细胞的增殖和炎性因子的分泌。