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核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是油菜菌核病的病原菌,每年造成油菜大量减产,经济损失巨大。重寄生真菌盾壳霉(Coniothyrium minntans)对核盘菌专性寄生,对核盘菌的生物防治有着广阔的应用前景。盾壳霉重寄生核盘菌过程中会分泌大量胞外丝氨酸蛋白酶,但其编码基因和功能还未见报道。那么,盾壳霉胞外丝氨酸蛋白酶的编码基因(CmSp)对其生长发育和重寄生有何影响?本研究从盾壳霉中成功克隆得到胞外CmSp基因。通过基因敲除和互补策略研究了盾壳霉胞外蛋白酶基因的功能,并尝试对其进行了外源表达,本研究获得如下结果:通过丝氨酸蛋白酶保守氨基酸序列设计简并引物,从盾壳霉Chy-1中扩增获得CmSp部分片段,比对盾壳霉基因组数据库获得全部CmSp基因序列11条,经过信号肽筛选和表达模式分析,最终获得两个胞外CmSp基因,即CmSp-9856和CmSp-2653。BLAST结果表明,CmSp-9856和CmSp-2653编码丝氨酸蛋白酶,均属于Subtilisin-like S8超家族,活性中心均含有Asp/Ser/His催化三联体。两个基因均在核盘菌菌核提取物诱导下上调表达,但CmSp-9856的表达量显著高于CmSp-2653。通过Split-Marker技术成功获得CmSp-9856和CmSp-2653敲除转化子,发现只有CmSp-9856敲除转化子的胞外蛋白酶活性显著降低,而CmSp-2653敲除转化子胞外蛋白酶活没有显著变化。对各转化子的生物学特性进行研究发现,CmSp-9856和CmSp-2653基因的缺失对盾壳霉的形态和生长发育没有影响。测定了各敲除突变体和互补转化子产生抗真菌物质(AFS)的能力,结果表明CmSp-9856和CmSp-2653对盾壳霉产生AFS均没有显著影响。此外,为了明确丝氨酸蛋白酶基因对盾壳霉重寄生能力的影响,进行了平板对峙及沙皿寄生菌核试验。结果显示,CmSp-9856敲除后,敲除转化子K9-22对核盘菌菌丝寄生能力减弱,并且对菌核的致腐能力显著减弱。CmSp-2653缺失突变体对核盘菌的寄生能力没有显著变化,这表明CmSp-9856基因可能在重寄生过程中起重要作用。此外,尝试对CmSp-9856和CmSp-2653进行原核表达,成功构建了表达载体,但只有CmSp-9856被成功诱导表达,检测到大小为30kDa的条带。以上结果表明,盾壳霉胞外丝氨酸蛋白酶的编码基因有两个,分别是CmSp-9856和Cmsp-2653。这两个基因均不会影响盾壳霉的生长发育。但是,CmSp-9856的缺失会导致盾壳霉胞外蛋白酶活性显著降低,并最终导致其重寄生能力显著下降。这说明盾壳霉胞外蛋白酶基因CmSp-9856在盾壳霉重寄生过程中发挥重要作用。