小分子荧光探针因结构可调控、特异性好、毒性小和可视化检测等独特的性能,已广泛应用于生物学、医学、药理学和环境科学等各个领域。目前,已报道了各种荧光探针用于生物学或环境科学中某些物质的检测。但是,在复杂的生物系统中,基于单个发射波长荧光强度信号的测量容易受到探针浓度、固有荧光、仪器和环境因素的影响,从而导致定量分析不准确;生物体系中不可避免的自吸收和自发荧光,使短波长发射的荧光探针不适合在组织和活体中进行深层成像,从而限制了它们在生物系统中的进一步应用。因此,本文通过设计比率或近红外（640-900 nm）的荧光探针,最大程度上减小自发荧光、自吸收等背景干扰,以实现复杂生物样品中活性物质的检测,并分别以常见生物活性物质碱性磷酸酶（ALP）、过氧化氢（H₂O₂）和半胱氨酸（Cys）为研究对象,设计合成了三种不同类型的荧光探针,具体内容如下:（1）基于ALP可催化水解各种底物上磷酸基团的特异性,设计合成了一种可见光发射的比率型荧光探针2,4-双（苯并[d]噻唑-2-基）苯基磷酸二氢盐（PDP）用于ALP检测。当加入ALP溶液时,PDP分子中的磷酸基团与ALP发生酶促反应,释放羟基,荧光发射红移,实现比率荧光检测ALP。其检测的线性范围为0.2-65 U/L,信噪比S/N=3时,检测限为9.94×10^-2 U/L。探针对ALP具有较高的选择性和灵敏度,成功用于人血清样品中ALP的检测。（2）基于H₂O₂与硼酸酯基的亲核取代反应,设计合成了一种可见光激发、近红外发射的比色和荧光双信号探针2-（（6-（（4-（4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基）苄基）氧基）-2,3-二氢-1H-蒽-4-基）亚甲基）丙二腈（DRP-B）用于H₂O₂检测。由于DRP-B分子结构中的硼酸酯基和丙二腈基都是吸电子基团,分子内电荷转移（ICT）效应受阻,荧光猝灭。当加入H₂O₂溶液时,DRP-B发生级联反应,释放羟基,ICT效应恢复,荧光增强,同时溶液的颜色从粉红色变为蓝色,实现了比色、近红外荧光双信号检测H₂O₂。H₂O₂浓度检测的线性范围为0.2-42μM,信噪比S/N=3时,检测限为1.20×10^-1μM。探针具有灵敏度高、选择性好及近红外发射的优势,成功应用于宫颈癌细胞（HeLa）及斑马鱼中H₂O₂的荧光成像分析。（3）基于Cys与丙烯酸酯基的加成-环化反应,设计合成了一种近红外激发/发射的比色和荧光双信号探针（E）-2-（2-（6-（丙烯酰氧基）-2,3-二氢-1H-蒽-4-基）乙烯基）-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化盐（DXM）用于Cys检测。由于DXM分子结构中的亚胺阳离子和丙烯酸酯基都是吸电子基团,分子内ICT效应受阻,荧光猝灭;当加入Cys溶液时,丙烯酸酯基离去,释放羟基,ICT效应恢复,荧光增强,同时溶液的颜色从紫色变为蓝色,实现了比色、近红外荧光双信号检测Cys。Cys浓度检测的线性范围为0.2-20μM,信噪比S/N=3时,检测限是1.02×10^-1μM。DXM具有灵敏度高、选择性好、细胞毒性小及近红外激发/发射的优势,成功应用于Hep G2细胞及斑马鱼中内源性Cys的荧光成像分析。