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研究背景与目的牙周炎是一种由细菌感染引起的炎症破坏性疾病,细菌及其产物引发机体的免疫反应,最终导致牙周组织的破坏,从而形成牙周炎。巨噬细胞作为参与机体免疫的重要细胞,其极化状态对炎症水平的调节至关重要。牙周治疗的最终目标是消除炎症和促进牙周组织结构和功能性的再生。牙龈间充质干细胞(Gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)因其来源广泛、易于培养和优异的抗炎、免疫调节功能,备受重视。在组织再生研究领域,间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的应用理念已经延伸到利用其来源的外泌体影响其它细胞的功能,调控机体微环境。外泌体是由多种细胞分泌的一种细胞外囊泡,具有细胞来源特异性。课题组前期研究证实GMSCs通过旁分泌作用影响高脂微环境下巨噬细胞的极化状态,从而调节炎症反应,因此我们推测牙龈间充质干细胞来源的外泌体(GMSCs derived exosomes,GMSCs-exos)具有和GMSCs相似的免疫调节作用。本研究旨在探讨GMSCs-exos对炎症条件下巨噬细胞表型和功能的调节作用,有望为牙周炎及机体其他炎症破坏性疾病的治疗提供理论依据和新思路。实验方法收集健康的牙龈组织,酶消化法分离培养得到GMSCs。成脂成骨诱导分化实验、克隆形成率(CFU-F)实验和流式细胞术对GMSCs的干细胞特性进行鉴定。收集第3-4代的GMSCs的上清液,超速离心法提取GMSCs-exos,采用纳米粒度分析仪和透射电子显微镜的方法进行其大小、形态的鉴定,使用免疫蛋白沉淀法(Western Blot)进行GMSCs-exos表面蛋白CD9、CD81、CD63的鉴定。将静息状态下的巨噬细胞(M0巨噬细胞)经脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)+γ干扰素(Gamma interferon,IFN-γ)联合刺激24 h后,再加入GMSCs-exos继续培养24 h,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和流式细胞术检测每组M1和M2巨噬细胞相关极化标记物的表达。酶联免疫吸附实验(ELISA)检测每组细胞上清液中致炎和抗炎因子的浓度。实验结果茜素红S和油红O染色结果显示GMSCs具有成脂、成骨分化能力。CFU-F结果显示GMSCs呈群落性生长。流式细胞仪检测显示GMSCs表面CD90、CD105、CD73阳性表达,CD45阴性表达。超速离心法获得的提取物在透射电子显微镜下呈典型的椭圆形双层膜状结构;在纳米粒度分析仪下粒径大小在100 nm左右;Western Blot结果显示其阳性表达CD9、CD81、CD63。以上鉴定证实我们提取到的物质即为GMSCs-exos。炎症刺激后的巨噬细胞加入GMSCs-exos后,ELISA检测结果显示:TNF-α浓度明显降低(P<0.05),IL-10浓度明显升高(P<0.05);qRT-PCR和流式细胞术结果显示:M1巨噬细胞相关标记物IL-12、IL-1β、TNF-α、CD86表达降低(P<0.05),M2巨噬细胞相关标记物IL-10表达升高(P<0.05),CD163的表达在组间无差异(P>0.05)。以上结果提示,GMSCs-exos能够促进炎症状态下的巨噬细胞向M2型极化,减轻炎症反应。结论GMSCs-exos促进炎症微环境下巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化,减轻炎症反应。