【摘 要】
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背景与目的:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）作为全球第三大死因已引起广泛关注。由于其发病较为隐匿,发现很多患者在查出患病时就已经到了疾病的中晚期。目前手术切除等传统治疗方法对中晚期肝细胞癌的治疗效果甚微。而索拉非尼等被FDA首次批准用于治疗肝细胞癌的靶向治疗药物也因其耐药性而限制了其疗效。近年来,众多研究学者为肝细胞癌的耐药这一问题付出了大量时间和精力。研究表明
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背景与目的:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）作为全球第三大死因已引起广泛关注。由于其发病较为隐匿,发现很多患者在查出患病时就已经到了疾病的中晚期。目前手术切除等传统治疗方法对中晚期肝细胞癌的治疗效果甚微。而索拉非尼等被FDA首次批准用于治疗肝细胞癌的靶向治疗药物也因其耐药性而限制了其疗效。近年来,众多研究学者为肝细胞癌的耐药这一问题付出了大量时间和精力。研究表明,PD-L1通常在耐药肿瘤中异常高表达,其介导的免疫逃逸作用可能与肿瘤的耐药性相关。然而,PD-L1在肝细胞性肝癌中的受调机制尚不清楚。本研究旨在阐明PD-L1在肝细胞性肝癌中的效应及其受调表达机制。方法:运用转染慢/腺病毒的方法成功构建了Huh-7PD-L1+、Huh-7SRPD-L1-、Huh-7c-Met+、Huh-7SRc-Met-、Huh-7SRp65-和Huh-7SRp65-c-Met-等六株细胞株。运用Western blot和RT-PCR方法评估各细胞组中PD-L1在蛋白和m RNA水平差异;运用细胞免疫化学方法和间接免疫荧光实验对各细胞组中PD-L1和c-Met进行定性和定位;CC-K8方法评估不同浓度索拉非尼对各细胞组的毒性及其细胞活力差异;JC-1方法检测不同浓度索拉非尼对各细胞组中凋亡的差异;用Ed U和克隆形成实验来评估各细胞组间的增殖能力差异;运用Transwell和划痕愈合实验来评估各细胞组间的迁移和侵袭能力;运用裸鼠皮下荷瘤实验通过肿瘤体积指标验证c-Met对PD-L1的调控机制;用组织免疫组化染色和蛋白免疫印迹验证各组间PD-L1蛋白水平的差异。结果:c-Met和PD-L1在Huh-7SR中异常高表达,而在Huh-7中表达水平较低。与Huh-7相比,在Huh-7c-Met+细胞株中PD-L1表达上调。与Huh-7SR相比,在Huh-7SRc-Met-细胞株中PD-L1表达水平下降。在探寻PD-L1的生物学功能时我们发现在高表达c-Met的Huh-7c-Met+细胞株中通过上调增殖分子P70S6K及迁移分子MMP2使增殖能力和迁移侵袭能力增加。而在Huh-7SRc-Met-细胞株中增殖能力和迁移侵袭能力下调。在接下来的PD-L1受控机制研究中,我们发现c-Met激活MAPK信号通路和下游NF-κBp65转录因子,与PD-L1启动子的近端区域相互结合上调PD-L1的表达。总之,在体外细胞层面,与Huh-7SR相比,Huh-7SRc-Met-细胞株和Huh-7SRp65-细胞株中PD-L1均有不同程度的下调。在体内裸鼠层面,与Huh-7SR相比,Huh-7SRc-Met-、Huh-7SRp65-和Huh-7SRp65-c-Met-荷瘤鼠肿瘤体积显著下调,且Huh-7SRp65-c-Met-组肿瘤体积最小。并通过抑制MAPK信号通路的活化进而抑制NF-κBp65转录因子,从而调控PD-L1的表达。进一步在体内证明c-Met通过MAPK/NF-κBp65信号通路来调控PD-L1的表达。结论:PD-L1在Huh-7SR细胞株中高表达。此外,c-Met与PD-L1表达水平呈正相关。c-Met通过MAPK/NF-κBp65通路调节PD-L1的转录,从而促进HCC的进展。c-Met和PD-L1有望成为治疗HCC的潜在靶点。图[27]表[0]参[50]
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