[研究背景]乙型病毒性肝炎,简称乙肝,是一种由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)引起的世界范围传播的疾病。乙型肝炎主要通过与被感染的人的血液和其它体液的接触传染。HBV感染是引起慢性肝病、肝硬化、肝细胞肝癌的主要原因。据世界卫生组织报道,全世界有20亿人感染过HBV,其中3.6亿以上为慢性感染,每年大约有60万人死于HBV感染的相关性肝病及肝细胞肝癌。注射对抗HBV感染的疫苗是目前有效预防HBV的最佳手段,但是仍然不能阻止HBV的传播。HBV自然感染的宿主范围狭窄,只局限于人类和大猩猩,因此目前HBV的研究缺少合适的动物模型,HBV的研究更多的依赖于细胞模型。HBV DNA转染的肝癌细胞系是体外研究HBV的结构与功能、基因表达与调控,以及药物筛选及耐药机制的有力工具,然而病毒进入肝癌细胞系的方式不是正常的感染而是转染或者整合,因此肝癌细胞系不能用于研究早期病毒-靶细胞的相互作用(例如病毒的吸附,穿入、脱衣壳等)。原代人肝细胞对HBV有着天然的易感性,但是来源有限(新鲜的肝脏组织),体外培养困难(不能传代、肝细胞特殊形态不能维持)等缺点限制了其做为细胞模型的可能。最近几年,与肝细胞相关的干细胞因为其强大的增殖能力和固有的生物学特性引起了人们的重视,肝细胞起源于骨髓细胞,骨髓细胞被视为肝细胞再生的重要源泉。骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)在特殊的诱导条件下体外能够诱导成具有肝功能的成熟的类肝细胞,动物模型显示移植入体内的诱导前或者诱导后的BMSCs均能恢复受损的肝细胞。但是人BMSCs是否对HBV易感,是否能成为研究HBV的细胞模型目前尚未有报道。本研究用HBV体外自然感染人BMSCs,探讨人BMSCs做为细胞模型研究HBV最初生命过程、HBV生物学特性、HBV与宿主细胞相互作用的早期机制及HBV耐药机制的可能性。本研究分为2个部分：第一部分人骨髓间充质干细胞的分离、培养和纯化[目的]探讨从人骨髓中分离、培养、纯化、扩增BMSCs的方法,建立稳定的人BMSCs,为后续HBV研究提供可靠的细胞模型。[方法]1.密度梯度离心法结合贴壁筛选法及酶消化控制法分离、培养、纯化人BMSCs。2.观察人BMSCs的细胞形态学特点,绘制人BMSCs(P5)的生长曲线,计算细胞对数生长期倍增时间。3.流式细胞术检测人BMSCs(P5)的群体DNA含量分布(细胞周期),常见的表面标志物。4.评估人BMSCs的传代、冻存和复苏的能力。[结果]1.成功分离培养了人BMSCs。细胞贴壁生长,形态均一,以梭形为主,边界清晰,胞核饱满居中,多成椭圆形,细胞排列具有一定方向性,密度高时成漩涡状或放射状排列。2.人BMSCs生长增殖旺盛,体外能长期培养扩增,生长曲线呈典型的“S”型,细胞对数生长期倍增时间为31h。符合间充质干细胞的特性。3.流式细胞术示人BMSCs细胞周期大部分处于静止期,小部分处于分裂周期,具有强大的增殖潜力；人BMSCs稳定高表达CD90、CD105,不表达CD34、 CD45。符合间充质干细胞的特性。4.人BMSCs可冻存,复苏后细胞形态学及生物学特性稳定,细胞生长增殖旺盛。符合细胞模型的特点。[结论]体外培养的人BMSCs生长稳定,增殖旺盛,能连续传代,可用于进一步的组织工程、细胞模型和分子生物学研究。第二部分乙肝病毒体外自然感染人骨髓间充质干细胞[目的]评估HBV体外自然感染人BMSCs后的复制、合成、表达能力,探讨人BMSCs做为细胞模型用于研究HBV的可能性。[方法]1. HBV DNA阳性(5.4×108copies/mL)的患者血清孵育培养的人BMSCs,感染细胞。2.荧光定量PCR方法检测HBV阳性血清孵育后的人BMSCs是否合成、分泌HBV DNA。3.DNA印迹法(Southern blotting)检测HBV是否在感染后的人BMSCs内有效复制,形成复制中间体：共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)。4.电化学发光法检测HBV阳性血清孵育后的人BMSCs是否表达、分泌乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)。5.间接免疫荧光方法检测HBV阳性血清孵育后的人BMSCs是否合成、表达乙肝病毒核心抗原(HBcAg)。6.阻断实验：将含10%的感染血清的双无培养基加入不同稀释度的抗HBsAg的特异性抗体按前述感染方法孵育人BMSCs检测病毒进入细胞的途径。[结果]1.HBV成功自然感染人BMSCs,感染后细胞形态学稳定,生长增殖旺盛。2.HBV阳性血清孵育后的第2天人BMSCs可以检测到HBV DNA,第6-12天维持在相对高的水平,HBV DNA最高值为9.37×105copies/mL; HBV阳性血清孵育后的第3-15天BMSCs培养上清中可以检测到HBV DNA, HBV DNA的含量分布在3.792×102copies/mL和4.067×105copies/mL之间。3. Southern blotting检测显示人BMSCs在HBV阳性血清孵育后第2天就可检测到HBV cccDNA的微弱信号(2.0kb),阳性信号随着培养进程的推进而增强。4.HBV阳性血清孵育后的人BMSCs能够持续分泌HBsAg和HBeAg到培养上清中。感染后第2-16天培养上清中能检测到HBsAg,最低值是1.612IU/mL,最高值是118.100IU/mL;感染后第5-13天培养上清中能检测到HBeAg呈阳性表达；HBeAg检测最低值是0.115s/co (absorbance rate/cut-off ratio),最高值是3.407s/co (≥1s/co为阳性)。5.HBV阳性血清孵育后的第2天开始人BMSCs可以检测到HBcAg。间接免疫荧光染色表现为胞浆内强烈的弥漫性着色,细胞核部分着色,大约7%的细胞核呈阳性表达,且数目随着培养进程的推进而增多,第9天达高峰,大约20%的细胞核呈阳性表达。6.抗HBsAg的抗体能够阻断HBV进入人BMSCs,阻断率与抗HBsAg的抗体的浓度有明显的量效关系。[结论]人BMSCs对HBV自然感染易感,能在病毒侵入后启动有效的病毒复制,形成复制中间产物HBV-cccDNA,表达HBV特异性抗原并合成子代病毒颗粒分泌出细胞。人BMSCs可以作为细胞模型用于研究HBV自然感染,进行HBV感染宿主细胞的早期过程(粘附、穿入、脱衣壳)及机制的研究,进行病毒-靶细胞相互作用机制的研究。