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转基因作物在过去的30多年中被大面积种植。2017年,全球转基因作物种植面积达1.898亿公顷,已成为一个巨大的产业。转基因技术的出现为人类解决粮食危机和生态危机带来了新的希望,可以采用转基因技术来获得高产、优质、抗逆的新产品,以此来满足人类对粮食等生活必需品的需求。在转基因操作中,常用微生物来源的抗性基因作为选择标记基因,筛选转化成功的细胞或植株。这是获得转基因植物的必要手段。然而,目前采用的选择标记基因主要来源于非食源微生物,给消费者带来食用安全性的担心,而且在获得转基因植物之后,选择标记基因实际上已不再需要。因此,有必要除去转基因植物中的这类选择标记基因。目前已通过转座子技术、共转化技术、位点特异性重组酶技术和同源重组技术等建立了删除转基因植物中的标记基因的方法。其中,Cre/LoxP重组酶系统研究的最为深入。虽然利用热激诱导启动子、花粉组织特异表达启动子等控制Cre/LoxP系统,可以获得无标记基因的转基因植株,但仍存在删除效率低等问题。本研究拟利用减数分裂启动子（M1P）、花粉/卵细胞特异表达杂合启动子（PolEM）、雌蕊/雄蕊特异表达杂合启动子（AGiM）和花粉/种子特异表达启动子（PAB5）,分别控制Cre/LoxP重组酶系统,转化烟草后分析它们对选择标记基因的删除效率,筛选出高效的标记基因自动删除系统,为今后获得无选择标记基因的转基因植物提供技术参考。主要结果如下:1.构建了含M1P::Cre/LoxP结构的载体pVCT2423,并证实减数分裂启动子M1P控制的Cre/LoxP系统不能够有效地自动删除标记基因构建了含有减数分裂启动子（M1P）控制Cre/LoxP重组系统的表达载体pVCT2423,并转入烟草进行了验证。利用不同引物对阳性植株的T1代幼苗基因组DNA进行PCR检测,发现10个阳性株系中仅有2个株系2423-1,2423-21中Cre基因发生了部分重组。2423-1株系检测了 56棵单株,2423-21株系检测了 24棵单株,其发生重组的效率分别为8.92%和8.33%。但这两个株系检测的单株中均不存在完全重组。T2代单株幼苗重组检测中,检测2423-1-1单株幼苗24棵,减数分裂启动子驱动Cre基因发生重组的效率为12.5%,这与预期删除效率差异较大。减数分裂启动子M1P控制Cre基因表达的效果并没有达到预期。2.构建了含PolEM::Cre/LoxP结构的载体pVCT2437,并证实花粉/卵细胞特异表达杂合启动子PolEM控制Cre/LoxP系统能够自动删除标记基因构建了含有花粉/卵细胞特异表达杂合启动子PolEM控制Cre/LoxP重组系统的表达载体pVCT2437,并导入到烟草基因组中。利用PCR技术对得到的T1代转基因株系基因组DNA进行扩增,发现只有一个株系2437-28转基因株系的基因组DNA进行了重组,接着对得到的T2代转基因单株幼苗基因组DNA进行扩增。单株2437-28-3、单株2437-28-5和单株2437-28-8检测的36棵幼苗中,Cre基因发生重组的效率分别为47.22%,75%和100%;Cre基因发生完全重组的效率分别为16.66%、16.66%和25%。测序结果也再次验证发生了完全重组。结果表明PolEM启动子能够有效地调控Cre基因的表达,得到标记基因自动删除的转基因植株。3.构建了含AGiM::Cre/LoxP结构的载体pVCT2424,并证实雌蕊/雄蕊特异表达杂合启动子AGiM控制Cre/LoxP系统能够有效地自动删除标记基因构建了以AGiM::Cre/LoxP结构为核心的雌蕊/雄蕊转基因删除系统。将该系统整合进烟草基因组后,得到11个阳性转基因烟草株系。在整个生长过程中,转基因烟草植株的单花花粉数量、单果种子数量和种子萌发率与野生型没有明显差异,说明在烟草基因组中导入AGiM::Cre/LoxP结构对它的生长和生殖没有影响。在检测的2424-37株系的3个单株的幼苗中,单株2424-37-3,2424-37-7,2424-37-10中Cre发生重组的效率分别为100%、83.33%和100%;Cre发生完全重组的效率分别为8.33%、8.33%和16.67%。结果表明构建出的AGiM杂合启动子能够有效地调控Cre基因的表达,得到标记基因自动删除的转基因植株。对比发现,雌蕊/雄蕊特异表达杂合启动子AGiM驱动Cre发生重组的效率高于花粉/卵细胞特异表达杂合启动子PolEM。4.构建了含有PAB5::Cre/LoxP结构的载体pVCT2446,并证实花粉/种子特异表达启动子PAB5控制Cre/LoxP系统能够有效地自动删除标记基因将含有PAB5::Cre/LoxP结构的载体pVCT2446转化烟草,并进行验证。通过PCR筛选得到阳性转基因烟草株系12株,在12个阳性T0代植株自交后代中,利用CTAB法提取gDNA后,利用PCR技术对得到的T1代转基因株系基因组DNA进行扩增,发现大部分转基因株系的基因组DNA进行了重组,并且有些株系的单株存在完全重组。其中株系2446-9,2446-11,2446-12中Cre基因重组效率分别为75%、66.67%和75%;Cre基因发生完全重组效率分别为25%、16.67%和33.33%。对比减数分裂启动子、花粉/卵细胞特异表达杂合启动子、雌蕊/雄蕊特异表达杂合启动子驱动Cre基因的重组效率,发现只有花粉/种子特异表达启动子驱动Cre基因在T1代转基因植株中发生完全重组,结果表明通过PAB5启动子来调控Cre/LoxP系统表达具有更高的删除效率。