急性肾功能衰竭是临床常见的严重肾脏疾病，肾缺血／再灌注损伤是急性肾功能衰竭的主要病因之一。缺血／再灌注所致的肾小管上皮细胞凋亡在急性肾功能衰竭的发生和发展中起关键的作用。细胞凋亡不仅是缺血后肾功能丧失的主要原因，也与缺血性心脏、脑和肝损伤密切相关，而抑制细胞凋亡可明显改善脏器功能。 Caspase家族是一组结构特征相似的半胱氨酸蛋白酶，细胞凋亡的发生与Caspase家族成员的活化密切相关。凋亡抑制蛋白(IAPs，inhibitor of apoptosisprotein)家族是唯一已知的内源性凋亡抑制因子，最早在杆状病毒中发现。XIAP是IAPs家族中最强的Caspase抑制剂，其N-末端有3个BIR(baculovirus IAPrepeat)的结构域：BIRl、BIR2、BIR3，羧基末端有RING指结构域(RING fingermotif)组成；BIR结构域是大约含有70个氨基酸的锌结合结构域，研究显示，BIR结构域对于XIAP发挥凋亡抑制作用是必不可少的，其中BIR1、BIR2之间的连接区域可以与Caspase-3、-7相结合，而BIR3则和Caspase-9相结合而发挥凋亡抑制作用，其羧基末端有1个RING结构域，具有E3泛素连接酶活性，能催化自身及靶蛋白通过泛素化而降解。大量体内、体外研究显示高表达XIAP可以明显抑制各种原因引起的凋亡，因此，在过度凋亡引起的各种疾病中，XIAP可能成为一个新的治疗靶点。 Smac／Diablo和HtrA2／Omi是两种新近发现的位于线粒体内外膜间隙的促凋亡蛋白质，是XIAP内源性拮抗因子。DIABLO(direct IAP binding protein withlow PI)和Omi是分别是人Smac(second mitochondria-derived activator of caspase)和HtrA2(high temperature requirement A2)的鼠类同源物。研究表明，Srnac/Diablo和HtrA2/Omi都拥有与高度保守的IAP的结合区域。在凋亡信号刺激下，Smac/Diablo、HtrA2/Omi由线粒体释放至胞浆中，与XIAP的BIR2、BIR3相互结合，进而消除XIAP对Caspase-3、-7、-9的抑制作用，促进凋亡的发生。此外，HtrA2/Omi还具有丝氨酸蛋白酶活性，可直接降解XIAP，使XIAP蛋白水平下调，导致XIAP抑制Caspase的作用减弱，从而促进细胞凋亡的发生。 热休克蛋白72(Heat shock protein 72，Hsp72)是HSPs家族中最易诱导和最重要的成员之一，也是在缺血性脏器损伤中研究较为广泛的一种。在正常状态下，作为分子伴侣能帮助新合成蛋白质的折叠、移位；在应激状态下，Hsp72表达明显增加，可使变性蛋白质复性或促进严重损伤蛋白质的降解，因而能保护细胞抵抗各种损伤。Hsp72也是一种抗凋亡的蛋白。Hsp72可从不同途径、不同水平抑制细胞凋亡的发生和发展。研究显示，Hsp72能在细胞色素C释放、apoptosome复合物形成、caspase酶启动等多个水平抑制caspase依赖性凋亡信号通路；还能与线粒体释放的AIF结合，阻止AIF进入细胞核，抑制caspase非依赖性凋亡信号通路。 但是，Hsp72能否通过抑制Smac/DIABLO、HtrA2/Omi由线粒体释放至胞浆，并抑制其与XIAP相互结合，防止HtrA2/Omi对XIAP的降解，保护XIAP的凋亡抑制作用，从而发挥抗细胞凋亡的作用?目前尚未见类似报道。因此，我们的研究目的是探讨Hsp72以XAIP为治疗靶点，发挥抗肾小管上皮细胞凋亡的作用机制。在体内实验中，我们用GGA特异性诱导tsp72高表达，观察大鼠缺血/再灌注损伤时，Hsp72对凋亡的发生情况及XIAP表达的影响；在体外实验中，我们应用肾小管上皮细胞ATP耗竭/再恢复的模型(缺血/再灌注肾损伤的体外模型)，并采用含有Hsp72RNA的腺病毒感染细胞，使其高表达Hsp72，从而进一步探讨Hsp72抑制Smac/DIABLO、HtrA2/Omi释放，保护XIAP，抑制细胞凋亡的机制。 第一部 分体内实验材料和方法 12只sD(Sprague-Dawley，SD)大鼠，夹闭左肾蒂45min后，松开血管夹并切除右肾，建立大鼠肾脏缺血／再灌注损伤模型。同时设6只大鼠作为假手术组，打开腹腔，分离肾血管周围组织，但不钳夹血管。在模型建立后第12h和24h各处死6只模型组大鼠，在第24h处死6只假手术组大鼠，留取冰冻组织、冰冻切片标本、病理和组织化学标本，处死前心脏穿刺取血标本，留取血清测血肌酐和尿素氮。肾组织石蜡切片行PAS染色，观察和评估肾组织肾小管损伤程度。肾小管损伤是指肾小管坏死、刷状缘的脱落、管型形成和小管扩张等，损伤程度采用损伤肾小管所占百分比评分法进行评估。TUNEL检测肾脏缺血／再灌注损伤时凋亡的发生情况，免疫组化检测cleaved caspase-3的表达，western-blot检测XIAP的蛋白水平。用GGA特异性诱导Hsp72高表达后，观察其对肾功能、肾小管损伤、TUNEL阳性细胞计数及XIAP蛋白表达水平的影响。 结果 1、肾脏缺血／再灌注时，可引起肾小管上皮细胞凋亡，肾功能受损；同时 XIAP蛋白水平降低，cleaved caspase-3活性增加，提示XIAP凋亡抑制作用减 弱，caspase依赖的凋亡信号通路活化。 2、特异性高表达Hsp72，可通过稳定XIAP蛋白水平，抑制肾脏缺血／再灌注所致的肾小管上皮细胞凋亡，减轻肾小管损伤，改善肾功能。 第二部分体外实验 HK-2细胞融合后，吸除含10％胎牛血清的DMEM培养液，PBS洗细胞三次，换用含5 mM氰化钠和5 mM去氧葡萄糖的无糖DMEM培养液，在37℃、5％CO<,2>条件下孵育90 min，以阻断细胞内的ATP生成，引起细胞ATP耗竭；随后换用含10 mM葡萄糖的DMEM培养液，使细胞ATP耗竭后再恢复，从而诱导细胞凋亡。用Hoechst检测细胞凋亡的发生；采用间接免疫荧光检测Smac／DIABLO的定位分布；提取胞浆蛋白，western-blot检测中Smac、HtrA2的含量；提取总蛋白检测xIAP、procaspase-3的蛋白水平；腺病毒感染HK-2细胞，诱导野生型Hsp72高表达，应用western-blot观察其对Smac、HtrA2、XIAP和procaspase-3蛋白水平的影响，联合免疫沉淀(Co-immunoprecipitation．Co-IP)分析HSP72与Smac、XIAP之间的相互作用。 结果 1、HK-2细胞ATP耗竭／再恢复时，Smac、HtrA2从线粒体释放至胞浆，XIAP蛋白水平降低，XIAP的凋亡抑制作用减弱，Caspase-3活化。 2、HK-2细胞特异性高表达Hsp72，可通过抑制细胞ATP耗竭／再恢复所致的线粒体蛋白Smac、HtrA2释放至胞浆,而且Hsp72和Smac、XIAP相互作用明显增强，XIAP被降解减少，从而稳定XIAP蛋白水平，保护其抑制细胞凋亡的作用。 结论 我们的研究证实，在肾脏缺血／再灌注损伤时，Hsp72可通过抑制线粒体蛋白Smac、HtrA2释放至胞浆，稳定XIAP的蛋白水平，保护XIAP的凋亡抑制作用，从而抑制肾小管上皮细胞凋亡，改善肾功能，为临床治疗肾脏缺血／再灌注损伤提供了新思路和策略。