H5N1 亚型高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)已造成全球家禽业的巨大经济损失。同时,H5N1 HPAIV对公共卫生也具有重要意义。自2003年首次报道H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenzaviruse,AIV)可以感染人以来,全球感染人数超过850人,死亡率约为50%,被认为是造成下一次人类流感大流行的潜在亚型之一。AIV主要通过点突变和基因重配发生变异,产生新病毒,从而导致病毒的致病性发生改变或导致宿主范围发生改变。因此,有必要解析H5亚型AIV对宿主的致病机理,为该病的防控提供理论依据。在前期研究发现聚合酶碱性蛋白2(Polymerase basic protein 2,PB2)I283M及K526R联合突变增强对小鼠致病性的基础上,进一步发现了 PB2-M283L/I的突变会导致H5亚型HPAIV对小鼠致病性的改变,证实了 PB2 283位点在AIV适应哺乳动物过程中的重要作用。同时,通过免疫沉淀技术(Immunoprecipitation,IP)结合液相色谱-串联质谱技术(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)对 PB2的宿主互作蛋白进行了筛选,通过进一步的生物信息学分析,揭示了 PB2蛋白在调控病毒生命周期及致病能力方面的作用。在此基础上,又分析了可能导致I283M及K526R联合突变影响哺乳动物致病性的关键宿主互作蛋白,为后续的机理研究打下基础。1.PB2-M283L/I突变对H5 HPAIV哺乳动物致病性的影响通过数据库中的流感病毒PB2基因序列分析,在PB2-283位点确定了新的突变模式M/L/I/L/T/V,以构建的H5亚型AIV反向遗传学平台为基础,构建了 PB2-M283L/I突变病毒,评估了其生物学特性和对小鼠的毒力差异。结果显示,与rWT病毒相比,PB2-M283L突变增强了病毒在哺乳动物细胞中的复制能力和聚合酶活性,增加了小鼠脏器中的病毒载量,增强了对小鼠组织病理学的损伤和导致更强的炎症因子风暴。PB2-M283I突变则与之呈现完全相反的表型。2.H5亚型HPAIV PB2互作宿主蛋白的筛选及分析为筛选与PB2互作的宿主蛋白,构建了表达带FLAG标签的H5亚型HPAIV PB2蛋白的真核表达载体,在293T细胞中过表达PB2蛋白,通过IP结合LC-MS/MS技术对蛋白进行鉴定和分析。结果筛选到至少490种可能与H5亚型HPAIVPB2互作的宿主蛋白。进一步的GO和Pathway分析,证明这些蛋白与病毒转录、病毒复制和免疫反应等方面有关。为了验证质谱数据的可靠性我们随机选取了 CHERP蛋白进行免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP),证明了其与PB2存在互作。通过与类似研究对比发现了 50种互作可能性极大的宿主蛋白,为下一步研究提供了基础。同时对PB2-I283M-K526R联合突变致互作蛋白差异进行了初步分析。将PB2-283I-526K与PB2-283M-526R互作蛋白组进行对比,初步筛选了 141种差异互作蛋白;Pathway分析发现差异蛋白主要集中于RNA转运通路。综上所述,PB2-M283L突变增强了 H5亚型AIV对小鼠的致病性,PB2-M283I作用相反。同时,通过Co-IP结合LC-MS/MS技术鉴定筛选到了 H5N8 AIV PB2互作宿主蛋白,并从蛋白互作角度分析了 AIV感染哺乳动物的机制。