肝脏作为人体中最重要的器官之一,承担着合成、分泌、代谢、解毒等多种复杂的功能,各种原因一旦造成肝细胞的大量坏死,将出现肝衰竭,导致机体代谢紊乱和毒性物质的堆积,而这反过来又加重了肝细胞的损伤,影响肝细胞的再生,形成肝衰竭的恶性循环。肝衰竭患者病情危重,进展迅速,预后凶险,尽管近年来内科综合治疗措施取得了较大进展,患者病死率依然高达80%,每年死于终末期肝病的患者超过50万,是临床亟待解决的难题。目前,唯一有效的治疗是原位肝移植。但目前遇到极大的困难：由于供体十分缺乏,绝大部分患者难以获得移植机会,很多病人在等待中死亡。术后免疫排斥反应严重、费用高昂等因素严重制约着肝移植的发展。目前,我国每年肝移植手术约5000例左右,且自2007年开始有下降趋势。人工肝技术(血液净化)是肝衰竭治疗的有效新途径。人工肝是借助体外机械、化学或生物性装置,暂时及部分替代肝脏的功能,从而协助治疗肝功能不全、肝衰竭或相关疾病的方法。人工肝支持系统可以辅助清除患者体内毒素、减轻肝脏负担、稳定各项生理、生化指标,是患者恢复肝功能的重要环节。部分患者经人工肝治疗后肝功能可以恢复；部分患者病情危重,难以耐受肝移植手术,只能接受人工肝治疗；在等待肝移植过程中,人工肝可以改善患者状态,为寻找供肝争取时间。目前国内大约已有700多家医院开展了机械人工肝治疗,获得一定疗效,但机械性人工肝治疗对患者生存率并无明显影响。大量实验研究显示,生物人工肝治疗的效果显著优于机械人工肝以及内科治疗。生物人工肝需求群体巨大,其治疗作用无可替代。在国外,生物型人工肝支持系统装置已进行临床研究。但是,其治疗效果未达到预期的疗效,仍然没有现成的产品。目前急需要一种能够应用于临床的商品化的新型生物型人工肝支持系统,能够提高重型肝病患者的生存率与临床治疗效果、遏制病情进展,促进肝脏再生,能起到内外科桥梁作用,能为广大肝衰竭患者带来福音。本课题组研发出了新一代的人工肝支持系统商品化样机,其具有独特的特点：1.此系统能够同时进行肝肾功能支持(人工肝以及CRRT持续性肾脏替代治疗)；2.能够选择多种治疗模式进行血液净化治疗；3.高度智能化以及程序机能化,操作简单、方便,能提供数据的安全操作。本项目拟通过新型生物人工肝支持系统的体内外实验来评估新型生物人工肝支持系统大动物实验的安全性以及稳定性,探讨人工肝治疗的相关技术问题,为生物人工肝有效性评估打下基础,为动物麻醉,模型制作,治疗方式选择,参数设置等提供经验。目的：1.通过新型生物人工肝系统的体外循环实验来初步总结该支持系统的参数设定、治疗模式的选择、稳定性、污染性的评估,为体内循环的大动物实验提供经验及技术支持。2.通过新型生物人工肝系统的体内循环实验进一步探索生物人工肝治疗模式的参数设置、评估大动物人工肝治疗实验的安全性及其稳定性,为有效性的评估实验奠定基础,提供帮助。方法：1.新型生物人工肝系统安全性的评估：体外循环实验。(1)管路的设计制作：根据机器进行闭合式水循环过程中的血流动力学情况将BLS(Blood Line System)-101-SD的人工肝管路进行拼接改造,最终设计出合适的生物人工肝管路；(2)检测系统各个蠕动泵转运速率：实验中将装载各个泵的相应路管,分别以100ml/min、200ml/min的速率转动,动静脉管的接口两端都浸入盛有蒸馏水的桶中,使反渗水以封闭的方式在血路管中循环,同时排除管路中的空气,然后把静脉管接口移至1L的量杯中,泵运转5分钟后,观测量筒的容积,以此来判断蠕动泵转运速率是否符合设定的速率；(3)通过局部法(单位时间内通过的体积)和整体法(进出体积差)测定整套管路以及血浆分离器、血液灌流器、生物反应罐的容量(以了解预充量)；(4)进行密闭式水循环,检测各个报警装置是否正常工作,检测有无气泡产生,有无漏气、漏血等；摸索出最适合人工肝治疗的参数设置,各个泵速最佳组合模式；并评估长时间治疗模式下的耐力性及其污染性。2.新型生物人工肝系统安全性的评估：体内循环实验。(1)生物人工肝实验猪模型制备：实验前适应性喂养1周,术前禁食水12h,自由饮水。氯胺酮肌肉注射诱导麻醉结合股静脉持续泵入丙泊酚维持麻醉,术中间断追加力月西(咪达唑仑注射液)镇静,待麻醉满意后,常规消毒铺单,并心电监护,观察实验过程中心电图、心率、呼吸频率、血氧饱和度。分别于股动脉及颈内静脉置管以备实验用。(2)实验猪肝肾支持系统上机：实验猪上机前所有管路以及滤器先用肝素盐水循环20mins,再用706代血浆预充管路,给予静脉注射地塞米松5mg,非那根(盐酸异丙嗪注射液)25mg肌肉注射,经双腔管按0.5mg·kg-1给予首剂肝素,启动肝素泵,按0.05mg·kg-1·h-1追加肝素,每小时监测活化部分凝血酶时间(APTT),根据活化部分凝血酶时间值调整肝素泵的速率,治疗结束前1h停止追加肝素。血泵流量调节为50ml/min-60ml/min,分浆泵流量调节为度15ml/min,倒向泵LDP1、LDP2流量调节为18ml/min、反应器往返周期0.4rain。连接压力监测器,检查各个报警装置。每头模型猪接受总共8小时的治疗,前2h模拟混合模式(血液吸附灌流联合生物人工肝治疗),后6h模拟单纯生物治疗模式(撤掉灌流器),每隔1小时记录1次静脉压、跨膜压、入浆壶压,动态监测猪的动脉血压、血氧饱和度、心率、呼吸、心电图。治疗过程中,每隔2小时候输入0.9%生理盐水200ml进行冲管,以防止堵塞滤器和管路,密切注意猪的胸廓起伏、生命体征的变化。治疗结束后,继续观察实验猪饮食、饮水、生命体征变化。同时从实验开始第0、4h、8h股静脉采血行血培养、内毒素测定(南方医科大学珠江医院检验科)。(3)统计学分析：数据以均数±标准差表示,样本均数间比较采用单向方差分析(One-Way ANOVA),系统稳定性采用质量控制图(control chart)进行分析,所有数据经SPSS13.0for Windows统计软件进行处理,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.体外循环实验：运用BLS(Blood Line System)-101-SD管路顺利的完成了三种治疗模式的管路制作；蠕动泵转速正常；灌流器预充量约300m1,生物反应罐预充量约为500m1,整条生物以及非生物部分管路约为300ml。经过局部与整体的实验,可以得出整个珠江Ⅰ号预充量约为1100m1。其中生物反罐500m1,灌流器预充量约300ra1,整条生物以及非生物部分管路约为300ml；在密闭式水循环全过程中,均未见明显大的气泡,未见管路爆破,未见漏水等情况,密闭式循环安全；血流不足检测器,漏血检测器,气泡检测器均运行良好,经过相应的处理后,可解决机器报警问题；在机器连续运行120个小时过程中,机器未出现故障,各个压力值稳定,密闭式循环安全,机器耐受性良好,内毒素测定：10管样本的内毒素测定结果均<5.0EU/ml;血培养结果：动、静脉端需氧、厌氧菌培养14天无细菌生长。2.体内循环实验：将6只猪在实验过程中以及实验结束后均存活良好。实验过程中未出现低血压、高血压、抽搐、透析综合症、发热、出血等不良反应。治疗7天后未见发热、切口感染、出血等并发症。生物人工肝机器运行过程中无故障,无管路爆破、漏血,血浆分离器未见破膜等情况,实验第0h、4h、8h抽血所测得的内毒素结果均小于0.5EU/ml,血培养结果显示培养15天未见细菌生长。西藏猪实验过程中的心电图无明显异常,各时间点平均动脉压、呼吸频率均数间无显著性差异(P>0.05),第2h心率与0h相比有显著性差异P<0.01(P=0.005),第2h心率的均数落在质控图下限外,血氧饱和度、呼吸频率、平均动脉压样本均数各时间点均在控制线内,均能维持相对稳定状态,第5小时出现心率加快,血氧饱和度降低,平均动脉压下降的情况。入浆壶压经Welch法校正后以及静脉压、跨膜压均满足方差齐性,经过方差分析发现不同时间点之间存在显著差异(F值分别为2.415,2.357,6.163,P<0.05),将第1-8小时的值与第0小时的值(对照组)进行比较后发现,静脉压、跨膜压、入浆壶压在第5小时与第0小时相比,明显增高(P<0.05),而其余各时间点与第0小时之间无显著性差异(P>0.05)；除了第5小时的均数点落在控制线以外,其余各点均在控制线内。结论：通过体外实验对实验参数及相关技术的探索,体内实验的进一步验证,说明在新型人工肝系统治疗过程中,猪的生命体征处于稳定状态,血流动力学相对稳定,猪的呼吸以及循环功能未受到不良影响,人工肝机器的各个压力监测值趋于稳定,动物的生命安全得以保证,在此基础上,我们可以进一步评价猪的肝衰竭模型的有效性。本实验对生物人工肝大动物体外循环、肾脏透析、肝衰竭模型的疗效评价等实验及远期临床应用可提供一定的经验及技术支持。