太平洋牡蛎是我国海水养殖业的重要品种之一，具有生长速度快、适应性强、出肉率高、肉质优良等特点，已逐步成为我国乃至全球牡蛎养殖的首选养殖品种。但从上世纪90年代以来，养殖的太平洋牡蛎在世界范围内出现了夏季大规模死亡现象。从2008年开始，法国养殖的太平洋牡蛎接连遭遇大规模死亡，牡蛎的死亡率达40％，有的甚至达到80％。1995-1996年，大连和山东沿海二龄以上个体死亡率达40％-50％，存活的个体也表现出生长缓慢、个体瘦弱、出肉率低等现象。这不但造成了巨大的经济损失，而且严重威胁到了牡蛎养殖产业的可持续发展。从太平洋牡蛎机体的免疫系统着手，尤其是免疫相关基因及其防御机制的研究，对太平洋牡蛎的健康养殖十分重要。本研究采取生物信息学、分子生物学、细胞生物学、免疫学等多种技术，对太平洋牡蛎天然免疫因子(HMGB1，AIF-1和IL-17基因家族)进行结构和功能研究，探讨了它们在太平洋牡蛎免疫防御中的作用。　　高迁移率族蛋白1(High mobility group box1 protein，HMGB1)是一种高度保守的DNA结合蛋白，参与核小体的形成和转录调控，亦可作为一种细胞外的细胞因子，引发炎症和免疫反应。在本研究中，我们利用RACE技术克隆了太平洋牡蛎HMGB1基因。通常情况下，太平洋牡蛎HMGB1定位于细胞核，脂多糖诱导可将其释放到细胞质中。荧光素酶报告基因检测表明太平洋牡蛎HMGB1不能单独激活NF-κB活性，但它可以增强Rel-依赖的NF-κB活性，并且存在剂量依赖性。qRT-PCR检测发现，HMGB1在淋巴细胞中的表达量最高。弧菌感染后，淋巴细胞中HMGB1 mRNA表达水平显著上升。上述研究结果表明，太平洋牡蛎HMGB1通过提高Rel依赖的NF-κB活性和诱导的炎症细胞因子的表达，在先天防御起着至关重要的作用。　　同种移植炎症因子-1(Allograft inflammatory factor-1，AIF-1)是具有EF-手形结构，由γ干扰素诱导的钙离子细胞因子。通过RACE技术我们克隆了太平洋牡蛎AIF-1的全长cDNA序列。利用SMART对其蛋白进行结构分析和功能预测，结果表明，与其他无脊椎动物一样，CgAIF-1也具有两个EF-手型结构。BlastⅩ结果显示CgAIF-1与目前已报道的相关AIF-1序列高度同源，系统进化树显示CgAIF-1与近江牡蛎的AIF-1首先聚为一支，然后与马氏珠母贝、鲍鱼、海绵、栉孔扇贝等的AIF-1聚为无脊椎动物，这与传统的分类地位中太平洋牡蛎的分类地位一致。注射了CgAIF-1重组蛋白后，太平洋牡蛎颗粒细胞的吞噬能力显著性的上调，而中间细胞和透明细胞的吞噬能力没有明显变化。另外，重组CgAIF-1蛋白能够诱导炎症因子IL-17、MIF和TNF mRNA的表达。组织分布结果表明CgAIF-1 mRNA在太平洋牡蛎所有的组织中都有分布，呈组成性表达，其中表达量最高的是鳃，其次是淋巴和消化腺，而在闭壳肌中较少。此外，当太平洋牡蛎淋巴细胞受到LPS、PGN、poly I∶C、HKLM和HKVA刺激后，CgAIF-1 mRNA表达水平显著上升。　　白介素17(Interleukin-17)是近年来发现的一种促炎症细胞因子，在抵抗胞外细菌、真菌感染的宿主防御以及各种自身免疫方面起到了重要的作用。通过对太平洋牡蛎基因组的分析，我们鉴定并克隆了5个新型的IL-17基因，多序列比对显示太平洋牡蛎各IL17成员间有4个保守的半胱氨酸。系统进化分析显示无脊椎动物的IL-17聚为一支，而其他脊椎动物的按照各个类型分别聚在不同支。结果表明无脊椎动物IL-17很有可能起源于共同的祖先基因，同时由于进化压力的存在，各自发展出各种亚型。染色体同线性分析表明，太平洋牡蛎6种IL-17基因分别分布于不同的染色体，不存在串联复制现象。与人类的IL-17基因相比，太平洋牡蛎IL-17基因结构相对简单，其基因长度和内含子外显子个数都低于人类IL-17基因。用TRANSFAC分析IL-17基因启动子序列发现，IL-17基因启动子含有多个转录调控位点，包括NF-κB，Oct-1，C/EBP，STAT，GATA，AP-1等结合位点。qRT-PCR检测发现，CgIL-17基因在太平洋牡蛎的各种组织中均有表达，其中在鳃中表达量较高。多种病原相关分子模式(PAMPs)包括poly(I∶C)，LPS，PGN，beta-1，3-glucan，HKLM和HKVA都能够诱导CgIL-17的表达。在不同胚胎发育时期，CgIL-17广泛表达，且不同的IL-17存在表达差异。　　另外，利用qRT-PCR和RACE技术克隆了太平洋牡蛎CgIL-17R以及下游的接头分子CgACT1基因的全长cDNA序列。SMART结构域分析发现CgIL-17R和CgACT1均具有一个SEFIR结构域。ACT1通过SEFIR结构域与 IL-17R中的SEFIR结构域相互作用传递信号。qRT-PCR显示，CgIL-17R mRNA广泛分布于各种组织中，在淋巴细胞、鳃和消化腺中的表达量较高，而在性腺和闭壳肌中的表达量最低。CgACT1 mRNA则主要在鳃、外套膜和消化腺中表达。原位杂交技术进一步验证了鳃和消化腺是CgIL-17R和CgACT1的重要合成场所。CgIL-17R mRNA在不同胚胎发育时期均有表达，在受精卵到到8细胞时期表达量均较高，从囊胚开始表达量逐渐降低直到D型幼虫时期开始上调。同样的，CgACT1 mRNA广泛地表达于不同胚胎发育时期，在D型幼虫时期表达量显著性上调。当太平洋牡蛎原代培养的血淋巴细胞受到PAMPs刺激后，CgIL-17R和CgACT1在mRNA的表达量水平显著上升。重组CgIL-17-1蛋白体内刺激太平洋牡蛎，不但可以诱导免疫炎症因子同种移植炎症因子1(AIF-1)，白介素17(IL-17)，巨噬细胞迁移因子(MIF)和肿瘤坏死因子(TNF) mRNA的表达，而且还能引起IL-17R、ACT1和TRAF6 mRNA表达量的变化。RNAi实验结果表明，dsRNA可以有效地介导CgIL-17R表达沉默。在干扰过程中，IL-17R基因在消化腺、鳃和淋巴细胞中的表达量在dsRNA注射7天后显著下降。同时，IL-17信号通路中的其他基因也相应下调。总体而言，在IL-17R mRNA的表达量被抑制之后，CgACT1和CgTRAF6 mRNA的表达量也呈下调趋势，表现出了类似的表达谱，证明了牡蛎中存在IL-17信号通路，为进一步研究其信号转导途径奠定了基础。　　综上所述，本研究首次克隆和鉴定了太平洋牡蛎CgHMGB1、CgAIF-1、5个CgIL-17、CgIL-17R和CgACT1全长cDNA。运用免疫学、分子生物学和细胞生物学等技术手段结合生物信息学分析，对其进行了结构和功能的研究，并探讨了它们在弧菌及病原相关模式分子感染中的作用，对其表达变化、亚细胞定位、细胞激活等进行了一系列的研究，为阐明牡蛎抗病机制提供了相关资料，也为丰富和发展海洋软体动物免疫学内容提供了分子生物学证据。