【摘 要】
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氨基葡萄糖-6-磷酸酯的生产制备方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法三种。酶法合成方面,早期以6-磷酸果糖、谷氨酰胺及三磷酸腺苷为原料在氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶催
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氨基葡萄糖-6-磷酸酯的生产制备方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法三种。酶法合成方面,早期以6-磷酸果糖、谷氨酰胺及三磷酸腺苷为原料在氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶催化下合成,另一种酶促转化法以氨基葡萄糖与ATP为原料,在已糖激酶作用下直接合成氨基葡萄糖-6-磷酸,由于酶源来源方便,三磷酸腺苷价格下降,副产物ADP回收利用及固定化酶的使用,该法工业化的可能性加大。本实验从土壤中分离筛选得到一株氨基葡萄糖激酶高产菌,并进行了培养基与培养条件的优化。在培养基优化过程中,着重考察了培养基中的碳源:氨基葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖;氮源:玉米浆、牛肉膏、酵母浸膏、蛋白胨、硫酸铵;无机离子:CaCl2·2H20、 MgS04·7H2O、FeS04·7H2O、CuSO4·5H2O、MnS04-5H20对酶发酵的影响。选择确定最佳碳源为氨基葡萄糖,最佳氮源为玉米浆,最佳无机盐为MgCl2-12H20。经正交实验确定最佳培养基组成为:氨基葡萄糖3%、玉米浆0.5%、MgCl2·12H200.03%;最佳发酵条件为:搅拌转速600rpm,发酵温度为30℃,通气量为5L/min,接种量为2%酶活力产量达到了145U/ml发酵液(以氨基葡萄糖为底物计)。本实验还考察了细胞破碎的三种方法,其中以SDS(十二烷基硫酸钠)法最好,最佳节条件为SDS浓度为为0.1%,EDTA浓度为3mmo1/L提取时间4小时,经超滤和DEAE纤维素层析后可纯化430倍,该酶,在5%葡萄糖存在条件经聚丙烯酰胺固定化,酶活力回收率可达45%,该固定化酶重复使用10次后酶活力仍保留50%。在酶促合成氨基葡萄糖-6-磷酸过程中,考察了反应温度及三种反应物的浓度对反应收率的影响,最佳条件为氨基葡萄糖2mmol, ATP1.8mmol,MgCl21.5mmol转化率最高可达90%,纯度98%以上,同时副产物中没有ATP,有利于ADP的进一步分离纯化回收利用,降低生产成本。
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