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●研究目的1.应用双向荧光差异凝胶电泳和质谱技术,建立绝经后POP患者与正常女性主骶韧带的蛋白质表达谱,筛选并鉴定POP患者与正常对照之间的差异表达蛋白。2.分析差异表达蛋白,探讨POP发生的分子机制。●材料和方法1.在绝经状态、年龄、体重指数、产次等影响POP发生的重要因素匹配的前提下,选取5例POP与5例无POP患者的子宫主骶韧带复合体标本。2.提取组织总蛋白,普通双向电泳分离,银染显色鉴定蛋白质抽提质量以及在胶图上的分布情况,并优化实验方法。3.荧光染料分别标记POP组、对照组以及内标,进行双向电泳得到双向荧光差异凝胶图谱。同时制作制备胶。对胶图进行匹配和差异分析,筛选出两组之间|AV.Ratio|≥1.5,P<0.05的差异表达蛋白质点。4.将差异蛋白质点胶内酶解后进行MALDI-TOF质谱分析和数据库搜索,鉴定差异表达的蛋白质点。●实验结果1.提取的组织蛋白经定量和普通双向电泳检测,蛋白质浓度符合实验要求,在胶图上分离情况满意,平均可获得1224±22个蛋白质点。2.获得5张双向荧光差异凝胶电泳胶图,每张胶图上共约1111±54个蛋白质点,经过比较分析筛选出33个差异表达蛋白质点,均在POP组下调,最大下调比例为8.5倍。3.质谱成功鉴定出12种蛋白,分别是白蛋白、纤维蛋白原、未知蛋白、电子传递黄素蛋白、血红蛋白、载脂蛋白A-I、肌动蛋白、转胶蛋白、丝切蛋白、亲环素A、肌球蛋白、半凝乳素-1。●结论1.经过机械研磨、匀浆以及超声破碎即可使韧带组织的提取蛋白质浓度和纯度基本满足实验要求,使用24cm PH3-10非线性胶条可以达到较为理想的蛋白质分离效果。双向电泳可作为筛选POP差异表达蛋白的研究方法。2.半凝乳素-1和亲环素A在神经损伤修复中发挥重要作用。这两种蛋白在POP组的下调说明盆底神经损伤可能是POP发生的病因之一。3.电子传递黄素蛋白的减少与线粒体异常相关,线粒体的异常可加重患者盆底组织的衰老程度,增加POP发生的风险。4.肌动蛋白、转胶蛋白、肌球蛋白和丝切蛋白的下调可导致细胞骨架异常以及收缩功能异常,使POP患者的盆底支持组织逐渐松弛形成脱垂。5.载脂蛋白A-I参与PPAR信号通路,对组织纤维化和收缩能力产生影响,可能是POP的发生机制之一。6.POP组血红蛋白表达较对照组显著减少,在一定程度上说明POP患者主骶韧带中血供减少。结合以往研究证实的绝经后女性生殖道血供减少,解释了绝经后女性易发生POP的临床现象。